CAJ | 학술논문

背景:最近研究发现硫酸软骨素蛋白多糖(NG2)在中枢神经系统中参与多种生理病理功能,慢病毒载体可感染分裂期细胞或非分裂期的细胞,并能在细胞内高效稳定的表达.目的:构建大鼠源性NG2基因shRNA慢病毒载体并检测其干扰效率.方法:选择大鼠NG2基因RNA干扰的靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生pLV-NG2-RNAi,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.将重组载体与pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体通过lipofectamineTM 2000共转染293T细胞包装产生慢病毒LV-NG2-RNAi,收集病毒上清并浓缩.采用孔稀释滴度测定法计算病毒滴度.将LV-NG2-RNAi慢病毒感染C6细胞,于感染后96 h提取细胞总蛋白,采用Western blot检测NG2的表达.结果与结论:经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目的序列一致,实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体LV-NG2-RNAi.包装浓缩慢病毒的滴度为8×1011 TU/L.Western blot检测显示在感染复数为50时,感染LV-NG2-RNAi慢病毒的C6细胞较感染对照慢病毒及未感染细胞NG2的表达明显降低,干扰效率可达100%(P < 0.05).结果证实了实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体,且该载体能够在细胞水平有效沉默靶基因.
배경:최근연구발현류산연골소단백다당(NG2)재중추신경계통중삼여다충생리병리공능,만병독재체가감염분렬기세포혹비분렬기적세포,병능재세포내고효은정적표체.목적:구건대서원성NG2기인shRNA만병독재체병검측기간우효솔.방법:선택대서NG2기인RNA간우적파서렬,합성Oligo DNA,퇴화형성쌍련DNA,여Hpa Ⅰ화Xho Ⅰ쌍매절후적pFU-GW-RNAi재체련접산생pLV-NG2-RNAi,PCR사선양성극륭,측서감정.장중조재체여pHelper 1.0재체、pHelper 2.0재체통과lipofectamineTM 2000공전염293T세포포장산생만병독LV-NG2-RNAi,수집병독상청병농축.채용공희석적도측정법계산병독적도.장LV-NG2-RNAi만병독감염C6세포,우감염후96 h제취세포총단백,채용Western blot검측NG2적표체.결과여결론:경PCR화측서증실구건편단대소급DNA서렬여목적서렬일치,실험성공구건대서NG2기인shRNA만병독재체LV-NG2-RNAi.포장농축만병독적적도위8×1011 TU/L.Western blot검측현시재감염복수위50시,감염LV-NG2-RNAi만병독적C6세포교감염대조만병독급미감염세포NG2적표체명현강저,간우효솔가체100%(P < 0.05).결과증실료실험성공구건대서NG2기인shRNA만병독재체,차해재체능구재세포수평유효침묵파기인.