CAJ | 학술논문

背景与目的:化疗是鼻咽癌最主要的辅助治疗手段,然而癌细胞耐药性的产生常常导致药物治疗的失败,因此,筛查鼻咽癌耐药相关基因、寻找逆转药物耐受的分子靶点具有重要的现实意义.本研究首先用鼻咽癌药物敏感细胞 CNE2作为亲本细胞诱导建立耐药细胞系,并在此基础上,筛选鼻咽癌耐药相关基因,探讨耐药性产生的分子机制.方法:以顺铂( cisplatin,DDP)为诱导剂,采用大剂量冲击与剂量逐渐递加相结合的方法,诱导建立人鼻咽癌耐药细胞系 CNE2/DDP.采用 MTT法测定药物的敏感性、流式细胞术测定细胞周期及细胞内荧光药物罗丹明的蓄积,并进行细胞生长曲线测绘、倍增时间测定及细胞形态学观察.随后,采用基于 PCR技术改良的消减杂交法筛选并克隆耐药相关基因.反向点杂交鉴定排除假阳性, DNA测序分析差异表达片段, RT- PCR对差异表达的基因片段做进一步验证.结果:所建立的人鼻咽癌耐药细胞系 CNE2/DDP对 DDP的耐药指数为 27.9,对 5-氟尿嘧啶( 5- fluorouracil,5- FU)及长春新碱( vincristine,VCR)的耐药指数分别可达 227.9和 55.5,表明其具有多药耐药的特征.流式细胞测定显示耐药细胞内罗丹明的蓄积明显低于敏感细胞( 12.98 vs. 243.62).镜下观察耐药细胞体积变小,形态变圆,细胞倍增时间明显延长( 26 h vs. 19 h).消减杂交发现了 6个差异表达的基因片段,其序列与人已知基因均有部分同源性,其中 3个在耐药细胞中高表达, 3个在耐药细胞中表达下调.高表达的序列中有一个是功能未知的恶性肿瘤相关基因,有完整的开放读码框,其编码产物是含有 79个氨基酸的 DC13蛋白,其余两个序列分别是泛素 C基因和线粒体编码基因 NADH脱氢酶亚单位 2( NADH dehydrogenase subunit 2,ND2).表达被抑制的基因序列分别是细胞色素氧化酶亚单位 1( cytochrome C oxidase subunit 1,COX1)、核糖体蛋白大亚基 27单体( ribosomal protein L27,RPL27)以及核糖体蛋白小亚基 27单体( ribosomal protein S27,RPS27).结论:建立了稳定的人鼻咽癌耐药细胞系 CNE2/DDP,为进一步研究恶性肿瘤的耐药机理建立了理想的耐药细胞模型.改良的消减杂交方法是克隆差异表达基因的有效方法,有多个功能已知和未知的基因如 DC13、COX1以及核糖核蛋白体基因等可能共同参与了鼻咽癌耐药性的产生. 揹景與目的:化療是鼻嚥癌最主要的輔助治療手段,然而癌細胞耐藥性的產生常常導緻藥物治療的失敗,因此,篩查鼻嚥癌耐藥相關基因、尋找逆轉藥物耐受的分子靶點具有重要的現實意義.本研究首先用鼻嚥癌藥物敏感細胞 CNE2作為親本細胞誘導建立耐藥細胞繫,併在此基礎上,篩選鼻嚥癌耐藥相關基因,探討耐藥性產生的分子機製.方法:以順鉑( cisplatin,DDP)為誘導劑,採用大劑量遲擊與劑量逐漸遞加相結閤的方法,誘導建立人鼻嚥癌耐藥細胞繫 CNE2/DDP.採用 MTT法測定藥物的敏感性、流式細胞術測定細胞週期及細胞內熒光藥物囉丹明的蓄積,併進行細胞生長麯線測繪、倍增時間測定及細胞形態學觀察.隨後,採用基于 PCR技術改良的消減雜交法篩選併剋隆耐藥相關基因.反嚮點雜交鑒定排除假暘性, DNA測序分析差異錶達片段, RT- PCR對差異錶達的基因片段做進一步驗證.結果:所建立的人鼻嚥癌耐藥細胞繫 CNE2/DDP對 DDP的耐藥指數為 27.9,對 5-氟尿嘧啶( 5- fluorouracil,5- FU)及長春新堿( vincristine,VCR)的耐藥指數分彆可達 227.9和 55.5,錶明其具有多藥耐藥的特徵.流式細胞測定顯示耐藥細胞內囉丹明的蓄積明顯低于敏感細胞( 12.98 vs. 243.62).鏡下觀察耐藥細胞體積變小,形態變圓,細胞倍增時間明顯延長( 26 h vs. 19 h).消減雜交髮現瞭 6箇差異錶達的基因片段,其序列與人已知基因均有部分同源性,其中 3箇在耐藥細胞中高錶達, 3箇在耐藥細胞中錶達下調.高錶達的序列中有一箇是功能未知的噁性腫瘤相關基因,有完整的開放讀碼框,其編碼產物是含有 79箇氨基痠的 DC13蛋白,其餘兩箇序列分彆是汎素 C基因和線粒體編碼基因 NADH脫氫酶亞單位 2( NADH dehydrogenase subunit 2,ND2).錶達被抑製的基因序列分彆是細胞色素氧化酶亞單位 1( cytochrome C oxidase subunit 1,COX1)、覈糖體蛋白大亞基 27單體( ribosomal protein L27,RPL27)以及覈糖體蛋白小亞基 27單體( ribosomal protein S27,RPS27).結論:建立瞭穩定的人鼻嚥癌耐藥細胞繫 CNE2/DDP,為進一步研究噁性腫瘤的耐藥機理建立瞭理想的耐藥細胞模型.改良的消減雜交方法是剋隆差異錶達基因的有效方法,有多箇功能已知和未知的基因如 DC13、COX1以及覈糖覈蛋白體基因等可能共同參與瞭鼻嚥癌耐藥性的產生.
배경여목적:화료시비인암최주요적보조치료수단,연이암세포내약성적산생상상도치약물치료적실패,인차,사사비인암내약상관기인、심조역전약물내수적분자파점구유중요적현실의의.본연구수선용비인암약물민감세포 CNE2작위친본세포유도건립내약세포계,병재차기출상,사선비인암내약상관기인,탐토내약성산생적분자궤제.방법:이순박( cisplatin,DDP)위유도제,채용대제량충격여제량축점체가상결합적방법,유도건립인비인암내약세포계 CNE2/DDP.채용 MTT법측정약물적민감성、류식세포술측정세포주기급세포내형광약물라단명적축적,병진행세포생장곡선측회、배증시간측정급세포형태학관찰.수후,채용기우 PCR기술개량적소감잡교법사선병극륭내약상관기인.반향점잡교감정배제가양성, DNA측서분석차이표체편단, RT- PCR대차이표체적기인편단주진일보험증.결과:소건립적인비인암내약세포계 CNE2/DDP대 DDP적내약지수위 27.9,대 5-불뇨밀정( 5- fluorouracil,5- FU)급장춘신감( vincristine,VCR)적내약지수분별가체 227.9화 55.5,표명기구유다약내약적특정.류식세포측정현시내약세포내라단명적축적명현저우민감세포( 12.98 vs. 243.62).경하관찰내약세포체적변소,형태변원,세포배증시간명현연장( 26 h vs. 19 h).소감잡교발현료 6개차이표체적기인편단,기서렬여인이지기인균유부분동원성,기중 3개재내약세포중고표체, 3개재내약세포중표체하조.고표체적서렬중유일개시공능미지적악성종류상관기인,유완정적개방독마광,기편마산물시함유 79개안기산적 DC13단백,기여량개서렬분별시범소 C기인화선립체편마기인 NADH탈경매아단위 2( NADH dehydrogenase subunit 2,ND2).표체피억제적기인서렬분별시세포색소양화매아단위 1( cytochrome C oxidase subunit 1,COX1)、핵당체단백대아기 27단체( ribosomal protein L27,RPL27)이급핵당체단백소아기 27단체( ribosomal protein S27,RPS27).결론:건립료은정적인비인암내약세포계 CNE2/DDP,위진일보연구악성종류적내약궤리건립료이상적내약세포모형.개량적소감잡교방법시극륭차이표체기인적유효방법,유다개공능이지화미지적기인여 DC13、COX1이급핵당핵단백체기인등가능공동삼여료비인암내약성적산생.