生物技术通讯
生物技術通訊
생물기술통신
LETTERS IN BIOTECHNOLOGY
2011年
2期
163-167
,共5页
王洪涛%俞岚%施庆国%李山虎%钱晓龙%周建光
王洪濤%俞嵐%施慶國%李山虎%錢曉龍%週建光
왕홍도%유람%시경국%리산호%전효룡%주건광
SGEF%DH结构域%载体构建%重叠PCR%基因表达%蛋白定位
SGEF%DH結構域%載體構建%重疊PCR%基因錶達%蛋白定位
SGEF%DH결구역%재체구건%중첩PCR%기인표체%단백정위
目的:通过构建带EGFP标签的SGEF基因DH结构域缺失的真核表达载体pEGFP-C1-SGEF-△DH并使其在293T细胞表达,观察DH结构域缺失后SGEF在293T细胞中的定位.方法:利用重叠PCR技术在pcDNA3.1-SGEF质粒上扩增缺失DH结构域的SGEF基因,然后将PCR产物亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1上,对阳性克隆进行双酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染293T细胞,并用Western印迹和细胞免疫荧光技术对重组质粒pEGFP-C1-SGEF-△DH在293T细胞中的表达及其蛋白定位进行分析.结果:双酶切和测序鉴定表明,pEGFP-C1-SGEF-△DH真核表达质粒构建成功,转染实验发现该质粒能够在293T细胞中表达,表达产物主要定位在细胞核内.结论:构建了带EGFP标签的人SGEF基因DH结构域缺失的真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞293T中表达,表达产物定位于细胞核,为进一步研究SGEF基因DH结构域的细胞生物学功能提供了一个重要的工具.
目的:通過構建帶EGFP標籤的SGEF基因DH結構域缺失的真覈錶達載體pEGFP-C1-SGEF-△DH併使其在293T細胞錶達,觀察DH結構域缺失後SGEF在293T細胞中的定位.方法:利用重疊PCR技術在pcDNA3.1-SGEF質粒上擴增缺失DH結構域的SGEF基因,然後將PCR產物亞剋隆到真覈錶達載體pEGFP-C1上,對暘性剋隆進行雙酶切和測序鑒定,利用脂質體轉染方法轉染293T細胞,併用Western印跡和細胞免疫熒光技術對重組質粒pEGFP-C1-SGEF-△DH在293T細胞中的錶達及其蛋白定位進行分析.結果:雙酶切和測序鑒定錶明,pEGFP-C1-SGEF-△DH真覈錶達質粒構建成功,轉染實驗髮現該質粒能夠在293T細胞中錶達,錶達產物主要定位在細胞覈內.結論:構建瞭帶EGFP標籤的人SGEF基因DH結構域缺失的真覈錶達載體,該載體能夠在哺乳動物細胞293T中錶達,錶達產物定位于細胞覈,為進一步研究SGEF基因DH結構域的細胞生物學功能提供瞭一箇重要的工具.
목적:통과구건대EGFP표첨적SGEF기인DH결구역결실적진핵표체재체pEGFP-C1-SGEF-△DH병사기재293T세포표체,관찰DH결구역결실후SGEF재293T세포중적정위.방법:이용중첩PCR기술재pcDNA3.1-SGEF질립상확증결실DH결구역적SGEF기인,연후장PCR산물아극륭도진핵표체재체pEGFP-C1상,대양성극륭진행쌍매절화측서감정,이용지질체전염방법전염293T세포,병용Western인적화세포면역형광기술대중조질립pEGFP-C1-SGEF-△DH재293T세포중적표체급기단백정위진행분석.결과:쌍매절화측서감정표명,pEGFP-C1-SGEF-△DH진핵표체질립구건성공,전염실험발현해질립능구재293T세포중표체,표체산물주요정위재세포핵내.결론:구건료대EGFP표첨적인SGEF기인DH결구역결실적진핵표체재체,해재체능구재포유동물세포293T중표체,표체산물정위우세포핵,위진일보연구SGEF기인DH결구역적세포생물학공능제공료일개중요적공구.
