北京农学院学报
北京農學院學報
북경농학원학보
JOURNAL OF BEIJING AGRICULTURAL COLLEGE
2011年
3期
24-27
,共4页
王卫婷%姚鹏%周赛%王黎霞%安健
王衛婷%姚鵬%週賽%王黎霞%安健
왕위정%요붕%주새%왕려하%안건
柔嫩艾美耳球虫%微线体蛋白4-N%毕赤酵母真核表达
柔嫩艾美耳毬蟲%微線體蛋白4-N%畢赤酵母真覈錶達
유눈애미이구충%미선체단백4-N%필적효모진핵표체
应用RT-PCR技术扩增柔嫩艾美耳球虫的MIC4-N端基因并去掉信号肽,为了表达检测和纯化的方便,设计引物时改变了3端的终止密码子,使MIC4-N的C末端带有c-myc和6His抗原标签.通过双酶切,使加工好的MIC4-N基因连接到毕赤酵母表达载体pPICZαA上,转化JM109感受态细胞.再经EcoR Ⅰ与Not Ⅰ双酶切、菌落PCR及测序鉴定,证明目的基因与真核表达载体pPICZαA构建成功,单酶切重组表达载体、电转转入GS115酵母感受态细胞中.用含高浓度Zeocin的YPD平板筛选酵母菌落,菌落PCR法鉴定转化成功的阳性菌,在BMMY培养基中摇瓶培养,并用甲醇诱导,经SDS-PAGE及Western Blot鉴定,蛋白分泌表达成功.
應用RT-PCR技術擴增柔嫩艾美耳毬蟲的MIC4-N耑基因併去掉信號肽,為瞭錶達檢測和純化的方便,設計引物時改變瞭3耑的終止密碼子,使MIC4-N的C末耑帶有c-myc和6His抗原標籤.通過雙酶切,使加工好的MIC4-N基因連接到畢赤酵母錶達載體pPICZαA上,轉化JM109感受態細胞.再經EcoR Ⅰ與Not Ⅰ雙酶切、菌落PCR及測序鑒定,證明目的基因與真覈錶達載體pPICZαA構建成功,單酶切重組錶達載體、電轉轉入GS115酵母感受態細胞中.用含高濃度Zeocin的YPD平闆篩選酵母菌落,菌落PCR法鑒定轉化成功的暘性菌,在BMMY培養基中搖瓶培養,併用甲醇誘導,經SDS-PAGE及Western Blot鑒定,蛋白分泌錶達成功.
응용RT-PCR기술확증유눈애미이구충적MIC4-N단기인병거도신호태,위료표체검측화순화적방편,설계인물시개변료3단적종지밀마자,사MIC4-N적C말단대유c-myc화6His항원표첨.통과쌍매절,사가공호적MIC4-N기인련접도필적효모표체재체pPICZαA상,전화JM109감수태세포.재경EcoR Ⅰ여Not Ⅰ쌍매절、균락PCR급측서감정,증명목적기인여진핵표체재체pPICZαA구건성공,단매절중조표체재체、전전전입GS115효모감수태세포중.용함고농도Zeocin적YPD평판사선효모균락,균락PCR법감정전화성공적양성균,재BMMY배양기중요병배양,병용갑순유도,경SDS-PAGE급Western Blot감정,단백분비표체성공.
