中华检验医学杂志
中華檢驗醫學雜誌
중화검험의학잡지
CHINESE JOURNAL OF LABORATORY MEDICINE
2007年
12期
1389-1394
,共6页
赵丹慧%张励力%蓝钒%王娜%袁越%张砚卓
趙丹慧%張勵力%藍釩%王娜%袁越%張硯卓
조단혜%장려력%람범%왕나%원월%장연탁
胶原Ⅱ型%抗体,单克隆%标本制备
膠原Ⅱ型%抗體,單剋隆%標本製備
효원Ⅱ형%항체,단극륭%표본제비
目的 制备Ⅱ型胶原C端肽中EKGPDP多肽片段(谷氨酸-赖氨酸-甘氨酸-脯氨酸-天冬氨酸-脯氨酸)的单克隆抗体(McAb),并进行抗体的纯化、鉴定及初步临床验证.方法 采用戊二醛法制备EKGPDP-钥孔嘁血蓝素(key hole limpet hemocyanin,KLH)抗原载体复合物.腹腔及静脉攻击法免疫BALB/c小鼠8只.按常规方法将小鼠骨髓瘤细胞和免疫小鼠脾细胞融合.筛选阳性克隆株,以有限稀释法克隆3次.对杂交瘤细胞株的染色体、亲和力、类型和稳定性进行鉴定,取其中亲和力较高的6株制备腹腔积液,用盐析及蛋白G琼脂糖凝胶珠层析法纯化抗体.对McAb的纯度、特异性、交叉反应性及免疫活性进行鉴定.用免疫组化法对骨性关节炎膝关节软骨和椎间盘软骨样品进行分析.结果 本研究获得13株能高效分泌特异性McAb的杂交瘤细胞株;经5个月传代35代和反复冻存复苏6次,培养上清稳定性良好.6株McAb腹腔积液效价分别为2.8×104(EKG7)、5.1×105(EKG14)、5.1×105(EKG16)、5.1×105(EKG18)、5.1×105(EKG25)、3.2×104(EKG28).电泳结果证明,盐析法纯化腹腔积液得到的单克隆抗体回收量、活性、存放1周后活性分别为8.07 mg、3.35(A450)、3.10(A450),蛋白G亲和层析法得到的单克隆抗体回收量、活性、存放1周后活性分别为0.32mg、1.83(A450)、0.66(A450),盐析法优于蛋白G亲和层析法(t=25.26,P＜0.01).抗体的最佳应用浓度为(50～150)μg/L.临床初步鉴定发现,6株EKGPDP单克隆抗体在骨性关节炎及突出椎间盘软骨标本中出现了不同程度的阳性结果.结论 本研究成功获得抗Ⅱ型胶原C端肽片段McAb,为Ⅱ型胶原降解产物的测定提供了研究工具.
目的 製備Ⅱ型膠原C耑肽中EKGPDP多肽片段(穀氨痠-賴氨痠-甘氨痠-脯氨痠-天鼕氨痠-脯氨痠)的單剋隆抗體(McAb),併進行抗體的純化、鑒定及初步臨床驗證.方法 採用戊二醛法製備EKGPDP-鑰孔嘁血藍素(key hole limpet hemocyanin,KLH)抗原載體複閤物.腹腔及靜脈攻擊法免疫BALB/c小鼠8隻.按常規方法將小鼠骨髓瘤細胞和免疫小鼠脾細胞融閤.篩選暘性剋隆株,以有限稀釋法剋隆3次.對雜交瘤細胞株的染色體、親和力、類型和穩定性進行鑒定,取其中親和力較高的6株製備腹腔積液,用鹽析及蛋白G瓊脂糖凝膠珠層析法純化抗體.對McAb的純度、特異性、交扠反應性及免疫活性進行鑒定.用免疫組化法對骨性關節炎膝關節軟骨和椎間盤軟骨樣品進行分析.結果 本研究穫得13株能高效分泌特異性McAb的雜交瘤細胞株;經5箇月傳代35代和反複凍存複囌6次,培養上清穩定性良好.6株McAb腹腔積液效價分彆為2.8×104(EKG7)、5.1×105(EKG14)、5.1×105(EKG16)、5.1×105(EKG18)、5.1×105(EKG25)、3.2×104(EKG28).電泳結果證明,鹽析法純化腹腔積液得到的單剋隆抗體迴收量、活性、存放1週後活性分彆為8.07 mg、3.35(A450)、3.10(A450),蛋白G親和層析法得到的單剋隆抗體迴收量、活性、存放1週後活性分彆為0.32mg、1.83(A450)、0.66(A450),鹽析法優于蛋白G親和層析法(t=25.26,P＜0.01).抗體的最佳應用濃度為(50～150)μg/L.臨床初步鑒定髮現,6株EKGPDP單剋隆抗體在骨性關節炎及突齣椎間盤軟骨標本中齣現瞭不同程度的暘性結果.結論 本研究成功穫得抗Ⅱ型膠原C耑肽片段McAb,為Ⅱ型膠原降解產物的測定提供瞭研究工具.
목적 제비Ⅱ형효원C단태중EKGPDP다태편단(곡안산-뢰안산-감안산-포안산-천동안산-포안산)적단극륭항체(McAb),병진행항체적순화、감정급초보림상험증.방법 채용무이철법제비EKGPDP-약공잡혈람소(key hole limpet hemocyanin,KLH)항원재체복합물.복강급정맥공격법면역BALB/c소서8지.안상규방법장소서골수류세포화면역소서비세포융합.사선양성극륭주,이유한희석법극륭3차.대잡교류세포주적염색체、친화력、류형화은정성진행감정,취기중친화력교고적6주제비복강적액,용염석급단백G경지당응효주층석법순화항체.대McAb적순도、특이성、교차반응성급면역활성진행감정.용면역조화법대골성관절염슬관절연골화추간반연골양품진행분석.결과 본연구획득13주능고효분비특이성McAb적잡교류세포주;경5개월전대35대화반복동존복소6차,배양상청은정성량호.6주McAb복강적액효개분별위2.8×104(EKG7)、5.1×105(EKG14)、5.1×105(EKG16)、5.1×105(EKG18)、5.1×105(EKG25)、3.2×104(EKG28).전영결과증명,염석법순화복강적액득도적단극륭항체회수량、활성、존방1주후활성분별위8.07 mg、3.35(A450)、3.10(A450),단백G친화층석법득도적단극륭항체회수량、활성、존방1주후활성분별위0.32mg、1.83(A450)、0.66(A450),염석법우우단백G친화층석법(t=25.26,P＜0.01).항체적최가응용농도위(50～150)μg/L.림상초보감정발현,6주EKGPDP단극륭항체재골성관절염급돌출추간반연골표본중출현료불동정도적양성결과.결론 본연구성공획득항Ⅱ형효원C단태편단McAb,위Ⅱ형효원강해산물적측정제공료연구공구.
