CAJ | 학술논문

目的设计、构建耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)耐药相关TGTPase嵌合基因,进行原核表达、纯化探索,为进一步利用其酶学活性建立抑制剂筛选系统奠定基础.方法通过引物设计,从盐平板法筛选的MRSA菌株中分别克隆PBP2的TG基因片段和PBP2a的TP片段,分别克隆入T载体,对阳性重组子进行酶切/再连接,构建TG-TPase嵌合基因,经核苷酸测序鉴定正确的嵌合基因再亚克隆到pET22b,构建表达载体,转化Rosetta(DE3)plysS,用LPTG进行诱导表达,并对表达的蛋白进行SDS-PAGE、质谱和Westem blotting鉴定.小量发酵重组菌,对嵌合基因表达产物进行初步纯化.结果从13株临床分离的金葡菌中筛选出2株高耐药性MRSA菌株,用PCR法从中成功地克隆到青霉素结合蛋白PBP2的TG片段和PBP2a的TP片段,构建了TG-TPase嵌合基因及其原核表达载体,并在大肠埃希菌中表达,产量达菌体总蛋白的43%.融合蛋白纯化分析表明,嵌合蛋白以包涵体形式存在,在变性条件下经Ni-NTA亲和柱纯化,纯度达90%以上.结论成功设计并构建了耐药性金葡菌TG-TPase嵌合基因及其重组表达工程菌,为进一步利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选奠定基础.
목적 설계、구건내갑양서림금황색포도구균(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)내약상관TGTPase감합기인,진행원핵표체、순화탐색,위진일보이용기매학활성건립억제제사선계통전정기출.방법 통과인물설계,종염평판법사선적MRSA균주중분별극륭PBP2적TG기인편단화PBP2a적TP편단,분별극륭입T재체,대양성중조자진행매절/재련접,구건TG-TPase감합기인,경핵감산측서감정정학적감합기인재아극륭도pET22b,구건표체재체,전화Rosetta(DE3)plysS,용LPTG진행유도표체,병대표체적단백진행SDS-PAGE、질보화Westem blotting감정.소량발효중조균,대감합기인표체산물진행초보순화.결과 종13주림상분리적금포균중사선출2주고내약성MRSA균주,용PCR법종중성공지극륭도청매소결합단백PBP2적TG편단화PBP2a적TP편단,구건료TG-TPase감합기인급기원핵표체재체,병재대장애희균중표체,산량체균체총단백적43%.융합단백순화분석표명,감합단백이포함체형식존재,재변성조건하경Ni-NTA친화주순화,순도체90%이상.결론 성공설계병구건료내약성금포균TG-TPase감합기인급기중조표체공정균,위진일보이용기매학활성진행항내약성금포균억제제적사선전정기출.