中国组织工程研究与临床康复
中國組織工程研究與臨床康複
중국조직공정연구여림상강복
JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH
2011年
46期
8671-8675
,共5页
李漫丽%戚卉%孙蕾%吴雅臻
李漫麗%慼卉%孫蕾%吳雅臻
리만려%척훼%손뢰%오아진
葡萄糖调节蛋白78%真核表达载体%稳定转染%绿色荧光蛋白%视网膜色素上皮细胞
葡萄糖調節蛋白78%真覈錶達載體%穩定轉染%綠色熒光蛋白%視網膜色素上皮細胞
포도당조절단백78%진핵표체재체%은정전염%록색형광단백%시망막색소상피세포
背景:葡萄糖调节蛋白78 是存在于内质网上最多的分子伴侣蛋白,具有保护细胞对抗细胞调亡的作用.目的:构建携带并正确表达外源性人葡萄糖调节蛋白78 基因的重组真核表达载体,建立葡萄糖调节蛋白78 基因稳定转染的人视网膜色素上皮细胞系.方法:扩增人葡萄糖调节蛋白78 全长编码序列,将该目的基因与真核表达载体PEGFP-N1 进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞,以PCR 方法鉴定阳性克隆,并进行测序和分析比对,获得融合蛋白表达质粒载体pEGFP-grp78.通过阳离子脂质体介导将重组质粒pEGFP-grp78 转染入体外培养的人视网膜色素上皮细胞,经G418 筛选,建立稳定表达细胞系.结果与结论:体外培养的人视网膜色素上皮细胞株作为真核细胞表达系统,经荧光显微镜和RT-PCR 方法检测,G418 筛选的稳定转染细胞系中GFP大量表达,葡萄糖调节蛋白78 mRNA 的表达量是正常视网膜色素上皮细胞的4 倍左右,表示脂质体介导的pEGFP-grp78 质粒成功转染视网膜色素上皮细胞,并高效稳定表达葡萄糖调节蛋白78.
揹景:葡萄糖調節蛋白78 是存在于內質網上最多的分子伴侶蛋白,具有保護細胞對抗細胞調亡的作用.目的:構建攜帶併正確錶達外源性人葡萄糖調節蛋白78 基因的重組真覈錶達載體,建立葡萄糖調節蛋白78 基因穩定轉染的人視網膜色素上皮細胞繫.方法:擴增人葡萄糖調節蛋白78 全長編碼序列,將該目的基因與真覈錶達載體PEGFP-N1 進行定嚮連接,其產物轉化細菌感受態細胞,以PCR 方法鑒定暘性剋隆,併進行測序和分析比對,穫得融閤蛋白錶達質粒載體pEGFP-grp78.通過暘離子脂質體介導將重組質粒pEGFP-grp78 轉染入體外培養的人視網膜色素上皮細胞,經G418 篩選,建立穩定錶達細胞繫.結果與結論:體外培養的人視網膜色素上皮細胞株作為真覈細胞錶達繫統,經熒光顯微鏡和RT-PCR 方法檢測,G418 篩選的穩定轉染細胞繫中GFP大量錶達,葡萄糖調節蛋白78 mRNA 的錶達量是正常視網膜色素上皮細胞的4 倍左右,錶示脂質體介導的pEGFP-grp78 質粒成功轉染視網膜色素上皮細胞,併高效穩定錶達葡萄糖調節蛋白78.
배경:포도당조절단백78 시존재우내질망상최다적분자반려단백,구유보호세포대항세포조망적작용.목적:구건휴대병정학표체외원성인포도당조절단백78 기인적중조진핵표체재체,건립포도당조절단백78 기인은정전염적인시망막색소상피세포계.방법:확증인포도당조절단백78 전장편마서렬,장해목적기인여진핵표체재체PEGFP-N1 진행정향련접,기산물전화세균감수태세포,이PCR 방법감정양성극륭,병진행측서화분석비대,획득융합단백표체질립재체pEGFP-grp78.통과양리자지질체개도장중조질립pEGFP-grp78 전염입체외배양적인시망막색소상피세포,경G418 사선,건립은정표체세포계.결과여결론:체외배양적인시망막색소상피세포주작위진핵세포표체계통,경형광현미경화RT-PCR 방법검측,G418 사선적은정전염세포계중GFP대량표체,포도당조절단백78 mRNA 적표체량시정상시망막색소상피세포적4 배좌우,표시지질체개도적pEGFP-grp78 질립성공전염시망막색소상피세포,병고효은정표체포도당조절단백78.
