军事医学
軍事醫學
군사의학
BULLETIN OF THE ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES
2012年
9期
673-677,697
,共6页
王文文%郝木强%刘春杰%靳继德%吴祖泽
王文文%郝木彊%劉春傑%靳繼德%吳祖澤
왕문문%학목강%류춘걸%근계덕%오조택
毕赤酵母%羧肽酶%基因敲除
畢赤酵母%羧肽酶%基因敲除
필적효모%최태매%기인고제
目的 通过基因敲除技术缺失毕赤酵母编码的羧肽酶Y(carboxypeptidase Y,CPY)基因cpy,观察其对毕赤酵母生长和外源蛋白表达的影响.方法 通过PCR方法扩增出内部含有潮霉素B抗性基因的cpy同源序列；通过电转法将同源序列转入GS115-EH感受态细胞中,并用潮霉素B筛选出阳性克隆.用平板显色法测定阳性克隆菌的羧肽酶活性,同时用PCR法鉴定阳性克隆菌的cpy基因是否缺失.对cpy基因缺失的GS115-EH△cpy菌,分别用YPD和BMGY-BMMY培养研究其生长特性；用BMMY培养基进行甲醇诱导表达外源蛋白,观察其蛋白表达的特性.结果 GS115-EH△cpy的羧肽酶基因cpy被成功敲除,羧肽酶活性丧失.YPD培养条件下,GS115-EH△cpy生长后期的D600明显低于GS115-EH,而用BMMY诱导培养基,GS115-EH△cpy的生长明显改善,但仍然低于对照菌.蛋白电泳结果显示甲醇诱导GS115-EH△cpy的蛋白表达量也低于对照菌.结论 GS115-EH△cpy的cpy基因被成功敲除,在YPD培养条件下,其生长低于对照菌,在BMMY培养条件下,其生长明显改善,但仍然较对照菌差,而且其外源蛋白的表达也低于对照菌.
目的 通過基因敲除技術缺失畢赤酵母編碼的羧肽酶Y(carboxypeptidase Y,CPY)基因cpy,觀察其對畢赤酵母生長和外源蛋白錶達的影響.方法 通過PCR方法擴增齣內部含有潮黴素B抗性基因的cpy同源序列；通過電轉法將同源序列轉入GS115-EH感受態細胞中,併用潮黴素B篩選齣暘性剋隆.用平闆顯色法測定暘性剋隆菌的羧肽酶活性,同時用PCR法鑒定暘性剋隆菌的cpy基因是否缺失.對cpy基因缺失的GS115-EH△cpy菌,分彆用YPD和BMGY-BMMY培養研究其生長特性；用BMMY培養基進行甲醇誘導錶達外源蛋白,觀察其蛋白錶達的特性.結果 GS115-EH△cpy的羧肽酶基因cpy被成功敲除,羧肽酶活性喪失.YPD培養條件下,GS115-EH△cpy生長後期的D600明顯低于GS115-EH,而用BMMY誘導培養基,GS115-EH△cpy的生長明顯改善,但仍然低于對照菌.蛋白電泳結果顯示甲醇誘導GS115-EH△cpy的蛋白錶達量也低于對照菌.結論 GS115-EH△cpy的cpy基因被成功敲除,在YPD培養條件下,其生長低于對照菌,在BMMY培養條件下,其生長明顯改善,但仍然較對照菌差,而且其外源蛋白的錶達也低于對照菌.
목적 통과기인고제기술결실필적효모편마적최태매Y(carboxypeptidase Y,CPY)기인cpy,관찰기대필적효모생장화외원단백표체적영향.방법 통과PCR방법확증출내부함유조매소B항성기인적cpy동원서렬；통과전전법장동원서렬전입GS115-EH감수태세포중,병용조매소B사선출양성극륭.용평판현색법측정양성극륭균적최태매활성,동시용PCR법감정양성극륭균적cpy기인시부결실.대cpy기인결실적GS115-EH△cpy균,분별용YPD화BMGY-BMMY배양연구기생장특성；용BMMY배양기진행갑순유도표체외원단백,관찰기단백표체적특성.결과 GS115-EH△cpy적최태매기인cpy피성공고제,최태매활성상실.YPD배양조건하,GS115-EH△cpy생장후기적D600명현저우GS115-EH,이용BMMY유도배양기,GS115-EH△cpy적생장명현개선,단잉연저우대조균.단백전영결과현시갑순유도GS115-EH△cpy적단백표체량야저우대조균.결론 GS115-EH△cpy적cpy기인피성공고제,재YPD배양조건하,기생장저우대조균,재BMMY배양조건하,기생장명현개선,단잉연교대조균차,이차기외원단백적표체야저우대조균.
