CAJ | 학술논문

目的:利用pET质粒原核表达体系克隆、表达阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,表达产物进行Ni-NTA柱纯化,利用α-葡萄糖苷酶分解4-硝基苯基-α-D-呋喃型葡萄糖的特性进行表达纯化合的蛋白活性鉴定,为进一步制备阪崎肠杆菌检测用单克隆抗体奠定了基础.方法:从阪崎肠杆菌ATCC29544标准菌株中克隆获得阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,连接pET22b(+)表达载体后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用不同浓度的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达外源基因,分别检测不同诱导时间、不同浓度IPTG作用下表达产物,筛选高表达菌株.表达菌株大量培养后,超声波及蛋白酶K作用破菌,Ni-NTA亲和柱纯化目的蛋白,纯化产物进行酶活性的测定.结果:克隆获得的α-葡萄糖苷酶基因与NCBI收录的基因序列属等位基因,核苷酸位点有多处差异,氨基酸序列也有不同.构建表达载体并诱导表达后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,目标蛋白相对分子质量约为65kD,与理论值相符.目标蛋白量约占菌体总蛋白量的18%.同时,由纯化结果可以看出,以500mmol/L咪唑洗脱时的纯化效果最理想,蛋白纯度可达90%以上.对表达产物进行过酶活性初步检测证重组的阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶能够分解4-硝基苯基-α-D-呋喃型葡萄糖,产生蓝绿色.结论:本研究中克隆获得了阪崎肠杆菌α-葡萄糖苷酶基因,通过构建pET22b(+)-Glu表达质粒转化大肠杆菌可获得基因重组的高表达菌株,表达产物具有较好的酶活性,纯化后纯度可达90%以上.
목적:이용pET질립원핵표체체계극륭、표체판기장간균α-포도당감매기인,표체산물진행Ni-NTA주순화,이용α-포도당감매분해4-초기분기-α-D-부남형포도당적특성진행표체순화합적단백활성감정,위진일보제비판기장간균검측용단극륭항체전정료기출.방법:종판기장간균ATCC29544표준균주중극륭획득판기장간균α-포도당감매기인,련접pET22b(+)표체재체후전화대장간균BL21(DE3)균주,이용불동농도적이병기류대-β-D-반유당감(IPTG)유도표체외원기인,분별검측불동유도시간、불동농도IPTG작용하표체산물,사선고표체균주.표체균주대량배양후,초성파급단백매K작용파균,Ni-NTA친화주순화목적단백,순화산물진행매활성적측정.결과:극륭획득적α-포도당감매기인여NCBI수록적기인서렬속등위기인,핵감산위점유다처차이,안기산서렬야유불동.구건표체재체병유도표체후,십이완기류산납-취병희선알응효전영(SDS-PAGE)검측,목표단백상대분자질량약위65kD,여이론치상부.목표단백량약점균체총단백량적18%.동시,유순화결과가이간출,이500mmol/L미서세탈시적순화효과최이상,단백순도가체90%이상.대표체산물진행과매활성초보검측증중조적판기장간균α-포도당감매능구분해4-초기분기-α-D-부남형포도당,산생람록색.결론:본연구중극륭획득료판기장간균α-포도당감매기인,통과구건pET22b(+)-Glu표체질립전화대장간균가획득기인중조적고표체균주,표체산물구유교호적매활성,순화후순도가체90%이상.