细胞与分子免疫学杂志
細胞與分子免疫學雜誌
세포여분자면역학잡지
2008年
1期
82-86
,共5页
杨化强%曹以诚%杜正平%卓敏%黄镜贤%李新建%石川%张珍武
楊化彊%曹以誠%杜正平%卓敏%黃鏡賢%李新建%石川%張珍武
양화강%조이성%두정평%탁민%황경현%리신건%석천%장진무
丙型肝炎%DNA疫苗%多表位抗原%siRNA%hIL-12
丙型肝炎%DNA疫苗%多錶位抗原%siRNA%hIL-12
병형간염%DNA역묘%다표위항원%siRNA%hIL-12
目的:构建多表位抗原基因、hIL-12、小分子干扰RNA(siRNA)共质粒表达的新型复合丙型肝炎DNA疫苗并在HepG2细胞中表达.方法:设计并合成复合多表位丙肝抗原基因,将其与加强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合克隆进真核表达载体pVAX1的多克隆位点中;利用pVAX1载体上卡那霉素抗性基因与复制起始位点之间的非功能区域,将带CMV启动子的hIL-12表达单元克隆进该区域的BspH Ⅰ位点中;同时将8组针对丙肝的siRNA表达单元分别克隆进载体复制起始位点下游非功能区域的Mlu Ⅰ位点上,构建三重表达的HCV DNA疫苗pVAX1-HC-EGFP-hIL12-siRNA.以该重组质粒转染人肝癌细胞系HepG2,通过EGFP的荧光标记观察多表位抗原的表达;以靶向EGFP的siRNA做为对照验证siRNA的表达及其干扰效果;ELISA测定培养细胞上清中hIL-12的表达.结果:经酶切鉴定和测序证实三重表达的复合HCV DNA疫苗构建成功.在转染细胞中检测到绿色荧光,证实抗原表达;靶向EGFP的siRNA亦能显著抑制EGFP的表达;转染后48 h hIL-12的检出量为1 289 ng/L细胞上清,72 h检出量为1 712 ng/L细胞上清.结论:成功地构建多表位抗原基因、hIL-12和siRNA共质粒表达的丙肝DNA疫苗,并能在真核细胞中有效表达抗原基因、hIL-12并介导RNA干扰效应.为进一步研究该DNA疫苗抗HCV的免疫治疗和基因治疗效果打下基础.
目的:構建多錶位抗原基因、hIL-12、小分子榦擾RNA(siRNA)共質粒錶達的新型複閤丙型肝炎DNA疫苗併在HepG2細胞中錶達.方法:設計併閤成複閤多錶位丙肝抗原基因,將其與加彊型綠色熒光蛋白(EGFP)基因融閤剋隆進真覈錶達載體pVAX1的多剋隆位點中;利用pVAX1載體上卡那黴素抗性基因與複製起始位點之間的非功能區域,將帶CMV啟動子的hIL-12錶達單元剋隆進該區域的BspH Ⅰ位點中;同時將8組針對丙肝的siRNA錶達單元分彆剋隆進載體複製起始位點下遊非功能區域的Mlu Ⅰ位點上,構建三重錶達的HCV DNA疫苗pVAX1-HC-EGFP-hIL12-siRNA.以該重組質粒轉染人肝癌細胞繫HepG2,通過EGFP的熒光標記觀察多錶位抗原的錶達;以靶嚮EGFP的siRNA做為對照驗證siRNA的錶達及其榦擾效果;ELISA測定培養細胞上清中hIL-12的錶達.結果:經酶切鑒定和測序證實三重錶達的複閤HCV DNA疫苗構建成功.在轉染細胞中檢測到綠色熒光,證實抗原錶達;靶嚮EGFP的siRNA亦能顯著抑製EGFP的錶達;轉染後48 h hIL-12的檢齣量為1 289 ng/L細胞上清,72 h檢齣量為1 712 ng/L細胞上清.結論:成功地構建多錶位抗原基因、hIL-12和siRNA共質粒錶達的丙肝DNA疫苗,併能在真覈細胞中有效錶達抗原基因、hIL-12併介導RNA榦擾效應.為進一步研究該DNA疫苗抗HCV的免疫治療和基因治療效果打下基礎.
목적:구건다표위항원기인、hIL-12、소분자간우RNA(siRNA)공질립표체적신형복합병형간염DNA역묘병재HepG2세포중표체.방법:설계병합성복합다표위병간항원기인,장기여가강형록색형광단백(EGFP)기인융합극륭진진핵표체재체pVAX1적다극륭위점중;이용pVAX1재체상잡나매소항성기인여복제기시위점지간적비공능구역,장대CMV계동자적hIL-12표체단원극륭진해구역적BspH Ⅰ위점중;동시장8조침대병간적siRNA표체단원분별극륭진재체복제기시위점하유비공능구역적Mlu Ⅰ위점상,구건삼중표체적HCV DNA역묘pVAX1-HC-EGFP-hIL12-siRNA.이해중조질립전염인간암세포계HepG2,통과EGFP적형광표기관찰다표위항원적표체;이파향EGFP적siRNA주위대조험증siRNA적표체급기간우효과;ELISA측정배양세포상청중hIL-12적표체.결과:경매절감정화측서증실삼중표체적복합HCV DNA역묘구건성공.재전염세포중검측도록색형광,증실항원표체;파향EGFP적siRNA역능현저억제EGFP적표체;전염후48 h hIL-12적검출량위1 289 ng/L세포상청,72 h검출량위1 712 ng/L세포상청.결론:성공지구건다표위항원기인、hIL-12화siRNA공질립표체적병간DNA역묘,병능재진핵세포중유효표체항원기인、hIL-12병개도RNA간우효응.위진일보연구해DNA역묘항HCV적면역치료화기인치료효과타하기출.
