中国自然医学杂志
中國自然醫學雜誌
중국자연의학잡지
CHINESE JOURNAL OF NATURAL MEDICINE
2008年
4期
246-249
,共4页
杨振%蒋建东%祁自柏%陈鸿珊%张华远%李河民
楊振%蔣建東%祁自柏%陳鴻珊%張華遠%李河民
양진%장건동%기자백%진홍산%장화원%리하민
丙型肝炎病毒%聚合酶%融合蛋白%原核表达%中药提取物
丙型肝炎病毒%聚閤酶%融閤蛋白%原覈錶達%中藥提取物
병형간염병독%취합매%융합단백%원핵표체%중약제취물
目的 构建HCV聚合酶基因的重组原核表达质粒后,研究了获得高效表达聚合酶蛋白的最适条件,同时摸索表达产物的纯化方法以及最佳变性和复性条件,研究建立细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型使用的HCV聚合酶作用模板及酶浓度的最佳浓度,为筛选药物创造条件.方法 使用高保真PfuDNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增,从我国HCV RNA阳性病人血清中扩增出HCV NSSb RNA聚合酶全长基因序列,构建了原核表达载体pET3OaNSSb等.在多个载体中选取pET-30a作为表达载体,选择各种诱导表达条件.进一步利用Ni2+金属离子螯和亲和层析将其纯化,对该酶蛋白的变性和复性条件进行研究.利用DNA-BAND培养板96孔板,建立生物素标记检测HCV NS5b聚合酶活性的细胞外分子模型.同时,摸索了聚合酶作用模板以及酶浓度对聚合酶模型的影响的相关条件.结果 测序及读码框架分析结果表明得到相关HCV NS5b RNA聚合酶全基因序列,在最佳表达条件下,诱导表达融合蛋白(65×103),得到了纯度大于92.83％的酶蛋白,研究确定了HCV聚合酶作用模板及酶浓度的最佳条件.结论 HCV聚合酶的高效表达和有效纯化,以及HCV聚合酶作用模板及酶浓度的最佳条件研究,为建立细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型及筛选药物奠定基础.
目的 構建HCV聚閤酶基因的重組原覈錶達質粒後,研究瞭穫得高效錶達聚閤酶蛋白的最適條件,同時摸索錶達產物的純化方法以及最佳變性和複性條件,研究建立細胞外丙型肝炎病毒聚閤酶複製模型使用的HCV聚閤酶作用模闆及酶濃度的最佳濃度,為篩選藥物創造條件.方法 使用高保真PfuDNA聚閤酶進行反轉錄及套式PCR擴增,從我國HCV RNA暘性病人血清中擴增齣HCV NSSb RNA聚閤酶全長基因序列,構建瞭原覈錶達載體pET3OaNSSb等.在多箇載體中選取pET-30a作為錶達載體,選擇各種誘導錶達條件.進一步利用Ni2+金屬離子螯和親和層析將其純化,對該酶蛋白的變性和複性條件進行研究.利用DNA-BAND培養闆96孔闆,建立生物素標記檢測HCV NS5b聚閤酶活性的細胞外分子模型.同時,摸索瞭聚閤酶作用模闆以及酶濃度對聚閤酶模型的影響的相關條件.結果 測序及讀碼框架分析結果錶明得到相關HCV NS5b RNA聚閤酶全基因序列,在最佳錶達條件下,誘導錶達融閤蛋白(65×103),得到瞭純度大于92.83％的酶蛋白,研究確定瞭HCV聚閤酶作用模闆及酶濃度的最佳條件.結論 HCV聚閤酶的高效錶達和有效純化,以及HCV聚閤酶作用模闆及酶濃度的最佳條件研究,為建立細胞外丙型肝炎病毒聚閤酶複製模型及篩選藥物奠定基礎.
목적 구건HCV취합매기인적중조원핵표체질립후,연구료획득고효표체취합매단백적최괄조건,동시모색표체산물적순화방법이급최가변성화복성조건,연구건립세포외병형간염병독취합매복제모형사용적HCV취합매작용모판급매농도적최가농도,위사선약물창조조건.방법 사용고보진PfuDNA취합매진행반전록급투식PCR확증,종아국HCV RNA양성병인혈청중확증출HCV NSSb RNA취합매전장기인서렬,구건료원핵표체재체pET3OaNSSb등.재다개재체중선취pET-30a작위표체재체,선택각충유도표체조건.진일보이용Ni2+금속리자오화친화층석장기순화,대해매단백적변성화복성조건진행연구.이용DNA-BAND배양판96공판,건립생물소표기검측HCV NS5b취합매활성적세포외분자모형.동시,모색료취합매작용모판이급매농도대취합매모형적영향적상관조건.결과 측서급독마광가분석결과표명득도상관HCV NS5b RNA취합매전기인서렬,재최가표체조건하,유도표체융합단백(65×103),득도료순도대우92.83％적매단백,연구학정료HCV취합매작용모판급매농도적최가조건.결론 HCV취합매적고효표체화유효순화,이급HCV취합매작용모판급매농도적최가조건연구,위건립세포외병형간염병독취합매복제모형급사선약물전정기출.
