蚌埠医学院学报
蚌埠醫學院學報
방부의학원학보
ACTA ACADEMIAE MEDICINAE BENGBU
2010年
1期
10-13
,共4页
范迟%高下%徐琳%朱光洁%陈杰%麻晓峰%丁小琼%陆玲%周函
範遲%高下%徐琳%硃光潔%陳傑%痳曉峰%丁小瓊%陸玲%週函
범지%고하%서림%주광길%진걸%마효봉%정소경%륙령%주함
腺病毒,人%人神经营养素-3%红色荧光蛋白%耳蜗圆窗
腺病毒,人%人神經營養素-3%紅色熒光蛋白%耳蝸圓窗
선병독,인%인신경영양소-3%홍색형광단백%이와원창
目的:构建含人神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)的重组腺病毒载体,为初步研究NT-3的在体功能做准备.方法:酶切法从已构建好的真核表达载体NT-3-pIRES2-DsRed2质粒中切下含有NT-3和DsRed2(包括连接区域pIRES2)的目的片段,将其插入到腺病毒骨架质粒pAdShuttle-CMV的多克隆位点中,电穿孔法将腺病毒骨架载体pAdShuttle-CMV-NT-3-DsRed2和预转入人肠杆菌BJ5183的穿梭载体pAdEasy-1进行细菌内同源重组.PacⅠ酶切线性化鉴定正确的同源重组载体,脂质体法转染293T细胞,包装形成表达NT-3目的蛋白和红色荧光的腺病毒.通过293T细胞3轮扩增病毒,氯化铯密度梯度离心,获得高滴度的纯化腺病毒.Western blot 方法检测蛋白表达情况.结果:同源重组质粒载体的DNA测序证实腺病毒载体中含有NT-3的目的片段,Western blot证实感染重组腺病毒的293T细胞中有相应的NT-3蛋白表达;病毒滴度为109 PFU/ml.结论:利用细菌内同源重组的方法可以成功构建同时表达NT-3蛋白和红色荧光的重组腺病毒.
目的:構建含人神經營養因子-3(neurotrophin-3,NT-3)的重組腺病毒載體,為初步研究NT-3的在體功能做準備.方法:酶切法從已構建好的真覈錶達載體NT-3-pIRES2-DsRed2質粒中切下含有NT-3和DsRed2(包括連接區域pIRES2)的目的片段,將其插入到腺病毒骨架質粒pAdShuttle-CMV的多剋隆位點中,電穿孔法將腺病毒骨架載體pAdShuttle-CMV-NT-3-DsRed2和預轉入人腸桿菌BJ5183的穿梭載體pAdEasy-1進行細菌內同源重組.PacⅠ酶切線性化鑒定正確的同源重組載體,脂質體法轉染293T細胞,包裝形成錶達NT-3目的蛋白和紅色熒光的腺病毒.通過293T細胞3輪擴增病毒,氯化銫密度梯度離心,穫得高滴度的純化腺病毒.Western blot 方法檢測蛋白錶達情況.結果:同源重組質粒載體的DNA測序證實腺病毒載體中含有NT-3的目的片段,Western blot證實感染重組腺病毒的293T細胞中有相應的NT-3蛋白錶達;病毒滴度為109 PFU/ml.結論:利用細菌內同源重組的方法可以成功構建同時錶達NT-3蛋白和紅色熒光的重組腺病毒.
목적:구건함인신경영양인자-3(neurotrophin-3,NT-3)적중조선병독재체,위초보연구NT-3적재체공능주준비.방법:매절법종이구건호적진핵표체재체NT-3-pIRES2-DsRed2질립중절하함유NT-3화DsRed2(포괄련접구역pIRES2)적목적편단,장기삽입도선병독골가질립pAdShuttle-CMV적다극륭위점중,전천공법장선병독골가재체pAdShuttle-CMV-NT-3-DsRed2화예전입인장간균BJ5183적천사재체pAdEasy-1진행세균내동원중조.PacⅠ매절선성화감정정학적동원중조재체,지질체법전염293T세포,포장형성표체NT-3목적단백화홍색형광적선병독.통과293T세포3륜확증병독,록화색밀도제도리심,획득고적도적순화선병독.Western blot 방법검측단백표체정황.결과:동원중조질립재체적DNA측서증실선병독재체중함유NT-3적목적편단,Western blot증실감염중조선병독적293T세포중유상응적NT-3단백표체;병독적도위109 PFU/ml.결론:이용세균내동원중조적방법가이성공구건동시표체NT-3단백화홍색형광적중조선병독.
