CAJ | 학술논문

目的从geldanamycin产生菌吸水链霉菌(S.hygroscopicus)中克隆生物合成基因,为阐明生物合成机制及改造其结构奠定基础.方法以链霉菌/大肠埃希氏菌穿梭cosmids pKC505为载体构建了插入片段为20～30kb的S.hygroscopicus总DNA文库.以利福霉素中与3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)合成相关基因为探针,经菌落杂交,Southern杂交筛选同源基因片段.测序结果与Genbank进行同源性比较分析,并以attp-噬菌体载体KC515利用基因阻断实验对克隆的基因片段进行功能鉴定.结果构建的基因文库含重组基因比率高、基因组覆盖率高,稳定性好.经同源基因探针杂交,从文库中筛选出9个阳性cosmids克隆pCGB20、pCGB26、pCGB28、pCGB29、pCGB36、pCGB45、pCGB49、pCGB63、pCGB75.测序分析表明,cosmidpCGB20中BamHI-BamHI 8kb片段两端的不完整ORF编码蛋白与竹桃霉素(oleandomycin)PKS Module 5、Module 6(一致性为79%)和红霉内酯合成酶ORF2(一致性为75%)、ORF1(一致性为73%)、ORF3(一致性为70%)高度同源;BamHI-BamHI 3kb片段一端与编码类结核分枝杆菌的磷酸吡哆醛依赖的氨基转移酶家族中半胱氨酸脱硫酶的DNA有同源性,该家族与AHBA合成酶关系密切.Cosmid pCGB20的BamHI-BamHI 8kb及BamHI-BamHI 3kb基因片段已通过基因阻断实验初步鉴定,证明它们参与geldanamycin生物合成.而其他cosmids阳性克隆的序列分析及功能研究尚在进行中.
목적종geldanamycin산생균흡수련매균(S.hygroscopicus)중극륭생물합성기인,위천명생물합성궤제급개조기결구전정기출.방법이련매균/대장애희씨균천사cosmids pKC505위재체구건료삽입편단위20～30kb적S.hygroscopicus총DNA문고.이리복매소중여3-안기-5-간기분갑산(AHBA)합성상관기인위탐침,경균락잡교,Southern잡교사선동원기인편단.측서결과여Genbank진행동원성비교분석,병이attp-서균체재체KC515이용기인조단실험대극륭적기인편단진행공능감정.결과구건적기인문고함중조기인비솔고、기인조복개솔고,은정성호.경동원기인탐침잡교,종문고중사선출9개양성cosmids극륭pCGB20、pCGB26、pCGB28、pCGB29、pCGB36、pCGB45、pCGB49、pCGB63、pCGB75.측서분석표명,cosmidpCGB20중BamHI-BamHI 8kb편단량단적불완정ORF편마단백여죽도매소(oleandomycin)PKS Module 5、Module 6(일치성위79%)화홍매내지합성매ORF2(일치성위75%)、ORF1(일치성위73%)、ORF3(일치성위70%)고도동원;BamHI-BamHI 3kb편단일단여편마류결핵분지간균적린산필치철의뢰적안기전이매가족중반광안산탈류매적DNA유동원성,해가족여AHBA합성매관계밀절.Cosmid pCGB20적BamHI-BamHI 8kb급BamHI-BamHI 3kb기인편단이통과기인조단실험초보감정,증명타문삼여geldanamycin생물합성.이기타cosmids양성극륭적서렬분석급공능연구상재진행중.