四川大学学报(医学版)
四川大學學報(醫學版)
사천대학학보(의학판)
JOURNAL OF WEST CHINA UNIVERSITY OF MEDICAL SCIENCES
2007年
6期
913-917
,共5页
陈蕾%冯培民%杨天华%田林郁%程新旺%周东
陳蕾%馮培民%楊天華%田林鬱%程新旺%週東
진뢰%풍배민%양천화%전림욱%정신왕%주동
多药耐药基因%RNA干扰%腺病毒%星形胶质细胞模型
多藥耐藥基因%RNA榦擾%腺病毒%星形膠質細胞模型
다약내약기인%RNA간우%선병독%성형효질세포모형
目的 构建抑制多药耐药基因(MDR1)表达的RNAi腺病毒载体,探讨基因治疗改善癫痫多重耐药现象的可行性.方法 根据大鼠MDR1基因序列,选择3个19nt的靶序列,设计并合成3对66nt含编码短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸,构建pSIREN-shuttle-MDR1重组质粒,测序分析正确后转染通过马桑内酯诱导的已表达多重耐药蛋白的大鼠星形胶质细胞,通过RT-PCR法测定多药耐药蛋白(P-gp)表达量,判断所设计的3条DNA序列对于P-gp表达的抑制作用.选择抑制效率最高的1个重组质粒,将其中的MDR1 shRNA表达结构酶切后插入腺病毒载体pAdeno-X,构建的pAdeno-MDR1经Pac1酶切后与脂质体共转染HEK293细胞进行病毒包装扩增纯化,所得病毒液作酶切电泳及测序分析正确后再转染大鼠星形胶质细胞模型.RT-PCR及免疫组织化学法分别测转染前后星形胶质细胞模型的MDR1及P-gp表达量.结果 重组质粒及pAdeno-MDR1病毒经PCR、酶切、测序分析证实构建正确.病毒滴度为6×109 pfu/mL.重组腺病毒转染星形胶质细胞后MDR1及P-gp表达量减少,干扰效率接近100%.结论 成功构建针对大鼠MDR1基因的RNAi腺病毒载体,并通过体外实验证实其对大鼠MDR1基因的高效抑制作用.为进一步探索难治性癫痫的多药耐药机制和基因治疗奠定了基础.
目的 構建抑製多藥耐藥基因(MDR1)錶達的RNAi腺病毒載體,探討基因治療改善癲癇多重耐藥現象的可行性.方法 根據大鼠MDR1基因序列,選擇3箇19nt的靶序列,設計併閤成3對66nt含編碼短髮夾RNA(shRNA)序列的寡覈苷痠,構建pSIREN-shuttle-MDR1重組質粒,測序分析正確後轉染通過馬桑內酯誘導的已錶達多重耐藥蛋白的大鼠星形膠質細胞,通過RT-PCR法測定多藥耐藥蛋白(P-gp)錶達量,判斷所設計的3條DNA序列對于P-gp錶達的抑製作用.選擇抑製效率最高的1箇重組質粒,將其中的MDR1 shRNA錶達結構酶切後插入腺病毒載體pAdeno-X,構建的pAdeno-MDR1經Pac1酶切後與脂質體共轉染HEK293細胞進行病毒包裝擴增純化,所得病毒液作酶切電泳及測序分析正確後再轉染大鼠星形膠質細胞模型.RT-PCR及免疫組織化學法分彆測轉染前後星形膠質細胞模型的MDR1及P-gp錶達量.結果 重組質粒及pAdeno-MDR1病毒經PCR、酶切、測序分析證實構建正確.病毒滴度為6×109 pfu/mL.重組腺病毒轉染星形膠質細胞後MDR1及P-gp錶達量減少,榦擾效率接近100%.結論 成功構建針對大鼠MDR1基因的RNAi腺病毒載體,併通過體外實驗證實其對大鼠MDR1基因的高效抑製作用.為進一步探索難治性癲癇的多藥耐藥機製和基因治療奠定瞭基礎.
목적 구건억제다약내약기인(MDR1)표체적RNAi선병독재체,탐토기인치료개선전간다중내약현상적가행성.방법 근거대서MDR1기인서렬,선택3개19nt적파서렬,설계병합성3대66nt함편마단발협RNA(shRNA)서렬적과핵감산,구건pSIREN-shuttle-MDR1중조질립,측서분석정학후전염통과마상내지유도적이표체다중내약단백적대서성형효질세포,통과RT-PCR법측정다약내약단백(P-gp)표체량,판단소설계적3조DNA서렬대우P-gp표체적억제작용.선택억제효솔최고적1개중조질립,장기중적MDR1 shRNA표체결구매절후삽입선병독재체pAdeno-X,구건적pAdeno-MDR1경Pac1매절후여지질체공전염HEK293세포진행병독포장확증순화,소득병독액작매절전영급측서분석정학후재전염대서성형효질세포모형.RT-PCR급면역조직화학법분별측전염전후성형효질세포모형적MDR1급P-gp표체량.결과 중조질립급pAdeno-MDR1병독경PCR、매절、측서분석증실구건정학.병독적도위6×109 pfu/mL.중조선병독전염성형효질세포후MDR1급P-gp표체량감소,간우효솔접근100%.결론 성공구건침대대서MDR1기인적RNAi선병독재체,병통과체외실험증실기대대서MDR1기인적고효억제작용.위진일보탐색난치성전간적다약내약궤제화기인치료전정료기출.
