山西医科大学学报
山西醫科大學學報
산서의과대학학보
JOURNAL OF SHANXI MEDICAL UNIVERSITY
2009年
8期
673-676
,共4页
restin%NLS/CKII位点%真核表达载体%核定位
restin%NLS/CKII位點%真覈錶達載體%覈定位
restin%NLS/CKII위점%진핵표체재체%핵정위
目的 构建人restin及其核定位信号序列(nuclear localization signal,NLS)、酪蛋白激酶Ⅱ(casein kinase Ⅱ,CKⅡ)作用位点缺失体基因rt1、rt2的真核表达载体并检测其在非洲绿猴肾细胞COS-7中的表达.方法 应用RT-PCR方法从体外培养的人胚肾细胞HEK293的mRNA中扩增出restin及其缺失体基因的编码区,克隆至pMD18T载体并测序,然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)3×flag,酶切鉴定正确后以脂质体法瞬时转染COS-7细胞,Western blot检测restin、rt1、rt2的表达及其亚细胞定位情况,从而确定功能位点缺失是否影响了Restin的核定位.结果 测序证实PCR扩增得到的restin、rt1、rt2基因编码区序列正确;脂质体法转染COS-7细胞后检测到预期目的 蛋白的表达.截取NLS/CKII位点阻滞了Restin的细胞核定位.结论 成功构建了restin及其缺失体基因的真核表达载体并使其在COS-7细胞中表达并检测到功能结构域的缺失引起蛋白Restin的核定位变化.
目的 構建人restin及其覈定位信號序列(nuclear localization signal,NLS)、酪蛋白激酶Ⅱ(casein kinase Ⅱ,CKⅡ)作用位點缺失體基因rt1、rt2的真覈錶達載體併檢測其在非洲綠猴腎細胞COS-7中的錶達.方法 應用RT-PCR方法從體外培養的人胚腎細胞HEK293的mRNA中擴增齣restin及其缺失體基因的編碼區,剋隆至pMD18T載體併測序,然後亞剋隆至真覈錶達載體pcDNA3.1(+)3×flag,酶切鑒定正確後以脂質體法瞬時轉染COS-7細胞,Western blot檢測restin、rt1、rt2的錶達及其亞細胞定位情況,從而確定功能位點缺失是否影響瞭Restin的覈定位.結果 測序證實PCR擴增得到的restin、rt1、rt2基因編碼區序列正確;脂質體法轉染COS-7細胞後檢測到預期目的 蛋白的錶達.截取NLS/CKII位點阻滯瞭Restin的細胞覈定位.結論 成功構建瞭restin及其缺失體基因的真覈錶達載體併使其在COS-7細胞中錶達併檢測到功能結構域的缺失引起蛋白Restin的覈定位變化.
목적 구건인restin급기핵정위신호서렬(nuclear localization signal,NLS)、락단백격매Ⅱ(casein kinase Ⅱ,CKⅡ)작용위점결실체기인rt1、rt2적진핵표체재체병검측기재비주록후신세포COS-7중적표체.방법 응용RT-PCR방법종체외배양적인배신세포HEK293적mRNA중확증출restin급기결실체기인적편마구,극륭지pMD18T재체병측서,연후아극륭지진핵표체재체pcDNA3.1(+)3×flag,매절감정정학후이지질체법순시전염COS-7세포,Western blot검측restin、rt1、rt2적표체급기아세포정위정황,종이학정공능위점결실시부영향료Restin적핵정위.결과 측서증실PCR확증득도적restin、rt1、rt2기인편마구서렬정학;지질체법전염COS-7세포후검측도예기목적 단백적표체.절취NLS/CKII위점조체료Restin적세포핵정위.결론 성공구건료restin급기결실체기인적진핵표체재체병사기재COS-7세포중표체병검측도공능결구역적결실인기단백Restin적핵정위변화.
