江苏大学学报（医学版）
江囌大學學報（醫學版）
강소대학학보（의학판）
JOURNAL OF JIANGSU UNIVERSITY (MEDICINE EDITION)
2010年
1期
36-39,51
,共5页
屈睿%刘加宝%桑建荣%任峰%赵爽%陈永昌
屈睿%劉加寶%桑建榮%任峰%趙爽%陳永昌
굴예%류가보%상건영%임봉%조상%진영창
Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶%腺病毒载体%DNA重组%胞外信号调节激酶
Ⅱ型cGMP依賴性蛋白激酶%腺病毒載體%DNA重組%胞外信號調節激酶
Ⅱ형cGMP의뢰성단백격매%선병독재체%DNA중조%포외신호조절격매
目的: 构建携带Ⅱ型cGMP依赖性蛋白激酶(PKGⅡ)基因的重组腺病毒载体,并以此初步研究PKGⅡ对增殖相关的MAPK信号转导的影响.方法: 将PKGⅡ cDNA片段自载体pRC/CMV-GKⅡ(wt)中切出,克隆至穿梭质粒pENTR 1A,用ClonaseⅡ将pENTR-PKGⅡ中的PKGⅡ cDNA片段定向克隆到pAd/CMV/V5-DEST中构建pAd/CMV/V5-DEST-PKGⅡ(Ad-PKGⅡ).重组质粒Ad-PKGⅡ用PacⅠ酶酶切,使其线性化,再用脂质体转染法转染HEK293A细胞进行包装和扩增,微量全细胞病变法检测病毒滴度,蛋白质印迹法检测重组腺病毒Ad-PKGⅡ感染细胞后PKGⅡ的表达以及MAPK通路关键成分胞外信号调节激酶(ERK)活性的变化.结果: 重组腺病毒滴度达5×109 pfu/ml,蛋白质印迹法检测显示重组腺病毒感染CS54细胞后使其PKGⅡ表达明显增高;在BGC-823胃癌细胞株, PKGⅡ对EGF导致的ERK的激活有明显抑制作用.结论: 成功构建了携带PKGⅡ基因的重组腺病毒,初步证明PKGⅡ对细胞增殖相关信号转导有抑制作用,为进一步研究PKGⅡ与肿瘤细胞发生发展的关系提供了基础.
目的: 構建攜帶Ⅱ型cGMP依賴性蛋白激酶(PKGⅡ)基因的重組腺病毒載體,併以此初步研究PKGⅡ對增殖相關的MAPK信號轉導的影響.方法: 將PKGⅡ cDNA片段自載體pRC/CMV-GKⅡ(wt)中切齣,剋隆至穿梭質粒pENTR 1A,用ClonaseⅡ將pENTR-PKGⅡ中的PKGⅡ cDNA片段定嚮剋隆到pAd/CMV/V5-DEST中構建pAd/CMV/V5-DEST-PKGⅡ(Ad-PKGⅡ).重組質粒Ad-PKGⅡ用PacⅠ酶酶切,使其線性化,再用脂質體轉染法轉染HEK293A細胞進行包裝和擴增,微量全細胞病變法檢測病毒滴度,蛋白質印跡法檢測重組腺病毒Ad-PKGⅡ感染細胞後PKGⅡ的錶達以及MAPK通路關鍵成分胞外信號調節激酶(ERK)活性的變化.結果: 重組腺病毒滴度達5×109 pfu/ml,蛋白質印跡法檢測顯示重組腺病毒感染CS54細胞後使其PKGⅡ錶達明顯增高;在BGC-823胃癌細胞株, PKGⅡ對EGF導緻的ERK的激活有明顯抑製作用.結論: 成功構建瞭攜帶PKGⅡ基因的重組腺病毒,初步證明PKGⅡ對細胞增殖相關信號轉導有抑製作用,為進一步研究PKGⅡ與腫瘤細胞髮生髮展的關繫提供瞭基礎.
목적: 구건휴대Ⅱ형cGMP의뢰성단백격매(PKGⅡ)기인적중조선병독재체,병이차초보연구PKGⅡ대증식상관적MAPK신호전도적영향.방법: 장PKGⅡ cDNA편단자재체pRC/CMV-GKⅡ(wt)중절출,극륭지천사질립pENTR 1A,용ClonaseⅡ장pENTR-PKGⅡ중적PKGⅡ cDNA편단정향극륭도pAd/CMV/V5-DEST중구건pAd/CMV/V5-DEST-PKGⅡ(Ad-PKGⅡ).중조질립Ad-PKGⅡ용PacⅠ매매절,사기선성화,재용지질체전염법전염HEK293A세포진행포장화확증,미량전세포병변법검측병독적도,단백질인적법검측중조선병독Ad-PKGⅡ감염세포후PKGⅡ적표체이급MAPK통로관건성분포외신호조절격매(ERK)활성적변화.결과: 중조선병독적도체5×109 pfu/ml,단백질인적법검측현시중조선병독감염CS54세포후사기PKGⅡ표체명현증고;재BGC-823위암세포주, PKGⅡ대EGF도치적ERK적격활유명현억제작용.결론: 성공구건료휴대PKGⅡ기인적중조선병독,초보증명PKGⅡ대세포증식상관신호전도유억제작용,위진일보연구PKGⅡ여종류세포발생발전적관계제공료기출.
