目的:用组织工程方法构建角膜上皮组织,观察自体工程化角膜上皮修复角膜缘缺陷症的可行性.方法:①实验于2000-01/2003-12在南京医科大学第一临床医学院中心实验室和内分泌科实验室完成.选用新西兰白兔15只,雌雄不拘.用手术方法做成单眼角膜缘缺陷动物模型,为移植实验的受体眼.另一只眼为供体眼.15只兔被随机分为3组:自体角膜上皮移植,羊膜移植组,对照组.②自体角膜上皮移植组:取供体眼角膜缘上皮组织约3 mm3,体外培养.对原代培养和传代培养的角膜干细胞进行形态学观察,采用糖原PAS反应鉴定细胞糖原染色;采用免疫组化法鉴定细胞角蛋白AE1表达;对培养细胞进行透射电镜和扫描电镜观察.在去除上皮的保存人羊膜组织上,接种培养细胞,气液界面培养2周构建复层上皮组织.倒置显微镜观察细胞形态和生长特征;组织固定,包埋,切片,染色,观察细胞生长状态和蛋白表达.透射电镜观察超微结构.5只眼成模后4周,受体眼去除角膜浅层新生血管膜,行自体培养角膜上皮移植术.羊膜移植组:5只眼成模后4周,行羊膜移植修复角膜表面;对照组:5只眼成模后不做处理,为模型对照组.③移植实验后7,10,20,30 d,分别行裂隙灯显微镜检查,角膜荧光素染色,眼前部照相.并分别处死各组动物,取手术区域角膜组织,甲醛固定,石蜡包埋,病理切片,染色,镜检观察.结果:①培养细胞的生长状态:原代培养48 h细胞贴壁,15 d左右形成单层.传代培养次日细胞贴壁,10 d形成良好的单层.细胞胞体饱满,呈多角形,大小基本一致.②培养细胞的形态学特征:苏木精-伊红染色,细胞呈多角形,核呈长圆形,细胞大小一致,排列整齐.AE1单克隆抗体染色阳性,PAS染色阴性.③培养细胞的超微结构:透射电镜可见培养细胞之间有桥粒连接,缝隙连接.扫描电镜可见细胞表面有微绒毛结构.④羊膜上接种细胞的生长特征:24 h细胞贴壁生长,1周左右融合成单层.气液界面培养,细胞透明饱满,均匀成片生长,持续培养2周,细胞呈复层生长.⑤组织工程化角膜上皮形态特征:苏木精-伊红染色,细胞呈多角形,在羊膜上融合成片.组织切片,细胞在羊膜上可达到四五层.透射电镜可见桥粒样结构.⑥自体组织工程化角膜上皮修复实验:自体角膜上皮移植组:移植区角膜上皮细胞覆盖,呈复层排列,基底细胞呈柱状,基底膜完整.基质内有炎性细胞和红细胞浸润.供体角膜未出现临床病理性损伤.羊膜移植组:移植区域表层有上皮细胞覆盖,层次紊乱,极性消失.基质内有炎性细胞和红细胞浸润.对照组:角膜上皮排列紊乱,基底膜不完整,基质内有中性白细胞和红细胞浸润.结论:①角膜干细胞在体外能够培养传代.②培养角膜干细胞在保存人羊膜上能够生长,经气液界面培养,构建出复层上皮组织,与正常角膜上皮组织近似.③自体工程化角膜上皮可用于修复角膜缘缺陷症.
目的:用組織工程方法構建角膜上皮組織,觀察自體工程化角膜上皮脩複角膜緣缺陷癥的可行性.方法:①實驗于2000-01/2003-12在南京醫科大學第一臨床醫學院中心實驗室和內分泌科實驗室完成.選用新西蘭白兔15隻,雌雄不拘.用手術方法做成單眼角膜緣缺陷動物模型,為移植實驗的受體眼.另一隻眼為供體眼.15隻兔被隨機分為3組:自體角膜上皮移植,羊膜移植組,對照組.②自體角膜上皮移植組:取供體眼角膜緣上皮組織約3 mm3,體外培養.對原代培養和傳代培養的角膜榦細胞進行形態學觀察,採用糖原PAS反應鑒定細胞糖原染色;採用免疫組化法鑒定細胞角蛋白AE1錶達;對培養細胞進行透射電鏡和掃描電鏡觀察.在去除上皮的保存人羊膜組織上,接種培養細胞,氣液界麵培養2週構建複層上皮組織.倒置顯微鏡觀察細胞形態和生長特徵;組織固定,包埋,切片,染色,觀察細胞生長狀態和蛋白錶達.透射電鏡觀察超微結構.5隻眼成模後4週,受體眼去除角膜淺層新生血管膜,行自體培養角膜上皮移植術.羊膜移植組:5隻眼成模後4週,行羊膜移植脩複角膜錶麵;對照組:5隻眼成模後不做處理,為模型對照組.③移植實驗後7,10,20,30 d,分彆行裂隙燈顯微鏡檢查,角膜熒光素染色,眼前部照相.併分彆處死各組動物,取手術區域角膜組織,甲醛固定,石蠟包埋,病理切片,染色,鏡檢觀察.結果:①培養細胞的生長狀態:原代培養48 h細胞貼壁,15 d左右形成單層.傳代培養次日細胞貼壁,10 d形成良好的單層.細胞胞體飽滿,呈多角形,大小基本一緻.②培養細胞的形態學特徵:囌木精-伊紅染色,細胞呈多角形,覈呈長圓形,細胞大小一緻,排列整齊.AE1單剋隆抗體染色暘性,PAS染色陰性.③培養細胞的超微結構:透射電鏡可見培養細胞之間有橋粒連接,縫隙連接.掃描電鏡可見細胞錶麵有微絨毛結構.④羊膜上接種細胞的生長特徵:24 h細胞貼壁生長,1週左右融閤成單層.氣液界麵培養,細胞透明飽滿,均勻成片生長,持續培養2週,細胞呈複層生長.⑤組織工程化角膜上皮形態特徵:囌木精-伊紅染色,細胞呈多角形,在羊膜上融閤成片.組織切片,細胞在羊膜上可達到四五層.透射電鏡可見橋粒樣結構.⑥自體組織工程化角膜上皮脩複實驗:自體角膜上皮移植組:移植區角膜上皮細胞覆蓋,呈複層排列,基底細胞呈柱狀,基底膜完整.基質內有炎性細胞和紅細胞浸潤.供體角膜未齣現臨床病理性損傷.羊膜移植組:移植區域錶層有上皮細胞覆蓋,層次紊亂,極性消失.基質內有炎性細胞和紅細胞浸潤.對照組:角膜上皮排列紊亂,基底膜不完整,基質內有中性白細胞和紅細胞浸潤.結論:①角膜榦細胞在體外能夠培養傳代.②培養角膜榦細胞在保存人羊膜上能夠生長,經氣液界麵培養,構建齣複層上皮組織,與正常角膜上皮組織近似.③自體工程化角膜上皮可用于脩複角膜緣缺陷癥.
목적:용조직공정방법구건각막상피조직,관찰자체공정화각막상피수복각막연결함증적가행성.방법:①실험우2000-01/2003-12재남경의과대학제일림상의학원중심실험실화내분비과실험실완성.선용신서란백토15지,자웅불구.용수술방법주성단안각막연결함동물모형,위이식실험적수체안.령일지안위공체안.15지토피수궤분위3조:자체각막상피이식,양막이식조,대조조.②자체각막상피이식조:취공체안각막연상피조직약3 mm3,체외배양.대원대배양화전대배양적각막간세포진행형태학관찰,채용당원PAS반응감정세포당원염색;채용면역조화법감정세포각단백AE1표체;대배양세포진행투사전경화소묘전경관찰.재거제상피적보존인양막조직상,접충배양세포,기액계면배양2주구건복층상피조직.도치현미경관찰세포형태화생장특정;조직고정,포매,절편,염색,관찰세포생장상태화단백표체.투사전경관찰초미결구.5지안성모후4주,수체안거제각막천층신생혈관막,행자체배양각막상피이식술.양막이식조:5지안성모후4주,행양막이식수복각막표면;대조조:5지안성모후불주처리,위모형대조조.③이식실험후7,10,20,30 d,분별행렬극등현미경검사,각막형광소염색,안전부조상.병분별처사각조동물,취수술구역각막조직,갑철고정,석사포매,병리절편,염색,경검관찰.결과:①배양세포적생장상태:원대배양48 h세포첩벽,15 d좌우형성단층.전대배양차일세포첩벽,10 d형성량호적단층.세포포체포만,정다각형,대소기본일치.②배양세포적형태학특정:소목정-이홍염색,세포정다각형,핵정장원형,세포대소일치,배렬정제.AE1단극륭항체염색양성,PAS염색음성.③배양세포적초미결구:투사전경가견배양세포지간유교립련접,봉극련접.소묘전경가견세포표면유미융모결구.④양막상접충세포적생장특정:24 h세포첩벽생장,1주좌우융합성단층.기액계면배양,세포투명포만,균균성편생장,지속배양2주,세포정복층생장.⑤조직공정화각막상피형태특정:소목정-이홍염색,세포정다각형,재양막상융합성편.조직절편,세포재양막상가체도사오층.투사전경가견교립양결구.⑥자체조직공정화각막상피수복실험:자체각막상피이식조:이식구각막상피세포복개,정복층배렬,기저세포정주상,기저막완정.기질내유염성세포화홍세포침윤.공체각막미출현림상병이성손상.양막이식조:이식구역표층유상피세포복개,층차문란,겁성소실.기질내유염성세포화홍세포침윤.대조조:각막상피배렬문란,기저막불완정,기질내유중성백세포화홍세포침윤.결론:①각막간세포재체외능구배양전대.②배양각막간세포재보존인양막상능구생장,경기액계면배양,구건출복층상피조직,여정상각막상피조직근사.③자체공정화각막상피가용우수복각막연결함증.
