华南农业大学学报
華南農業大學學報
화남농업대학학보
JOURNAL OF SOUTH CHINA AGRICULTURAL UNIVERSITY
2009年
1期
81-85
,共5页
房红莹%陈钜豪%张欣%胡寻%罗满林
房紅瑩%陳鉅豪%張訢%鬍尋%囉滿林
방홍형%진거호%장흔%호심%라만림
牛白细胞介素15%基因克隆%原核表达
牛白細胞介素15%基因剋隆%原覈錶達
우백세포개소15%기인극륭%원핵표체
根据cenBankTM中发表的牛IL-15基因序列设计并合成了特异性引物,以经LPS和ConA刺激的牛外周血单个核细胞提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出长度约500 bp的目的基因片段,并将该基因克隆到pMD18-T载体上.酶切、PCR及序列测定结果表明,获得了牛IL-15全长基因的克隆.进一步通过PCR方法得到缺失其N端48个氨基酸的信号肽序列的牛IL-15成熟蛋白基因,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a上,构建重组表达质粒pET-IL-15,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,该菌表达以包涵体形式存在的相对分子质量约为33 000的融合蛋白.用Ni螯合层析方法纯化表达的蛋白.Western-blot试验显示表达的重组融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应,同时也能与鼠抗猪IL-15的多克隆抗体发生明显交叉反应.
根據cenBankTM中髮錶的牛IL-15基因序列設計併閤成瞭特異性引物,以經LPS和ConA刺激的牛外週血單箇覈細胞提取的總RNA為模闆,用RT-PCR方法擴增齣長度約500 bp的目的基因片段,併將該基因剋隆到pMD18-T載體上.酶切、PCR及序列測定結果錶明,穫得瞭牛IL-15全長基因的剋隆.進一步通過PCR方法得到缺失其N耑48箇氨基痠的信號肽序列的牛IL-15成熟蛋白基因,將其亞剋隆到原覈錶達載體pET-32a上,構建重組錶達質粒pET-IL-15,轉化大腸桿菌BL21(DE3),經IPTG誘導,該菌錶達以包涵體形式存在的相對分子質量約為33 000的融閤蛋白.用Ni螯閤層析方法純化錶達的蛋白.Western-blot試驗顯示錶達的重組融閤蛋白能與抗6×His的單剋隆抗體髮生反應,同時也能與鼠抗豬IL-15的多剋隆抗體髮生明顯交扠反應.
근거cenBankTM중발표적우IL-15기인서렬설계병합성료특이성인물,이경LPS화ConA자격적우외주혈단개핵세포제취적총RNA위모판,용RT-PCR방법확증출장도약500 bp적목적기인편단,병장해기인극륭도pMD18-T재체상.매절、PCR급서렬측정결과표명,획득료우IL-15전장기인적극륭.진일보통과PCR방법득도결실기N단48개안기산적신호태서렬적우IL-15성숙단백기인,장기아극륭도원핵표체재체pET-32a상,구건중조표체질립pET-IL-15,전화대장간균BL21(DE3),경IPTG유도,해균표체이포함체형식존재적상대분자질량약위33 000적융합단백.용Ni오합층석방법순화표체적단백.Western-blot시험현시표체적중조융합단백능여항6×His적단극륭항체발생반응,동시야능여서항저IL-15적다극륭항체발생명현교차반응.
