现代食品科技
現代食品科技
현대식품과기
MODERN FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
2009年
9期
993-997
,共5页
R-spondin1%增强型绿色荧光蛋白%腺相关病毒%流式细胞技术
R-spondin1%增彊型綠色熒光蛋白%腺相關病毒%流式細胞技術
R-spondin1%증강형록색형광단백%선상관병독%류식세포기술
本文通过构建携带Rspo1-EGFP融合基因的重组腺相关病毒载体,包装出含有目标基因的重组腺相关病毒.首先利用PCR从cDNA文库中把Rspo1基因扩增出来,插入到pcDNA6-EGFP中EGFP的上游形成融合基因Rspo1-EGFP.采用AAV Helper-free包装系统,将融合基因用PCR方法从质粒pcDNA6-Rspo1-EGFP上扩增出来,亚克隆到AAV表达质粒pAAV-MCS多克隆位点中,构建出重组质粒pAAV-Rspo1-EGFP.重组质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper磷酸钙法共转染AAV-293细胞制备重组病毒rAAV-Rspo1-EGFP.重组病毒感染AAV-HT1080细胞,荧光显微镜检测病毒介导的目标基因表达,流式细胞技术测定病毒滴度.结果:酶切鉴定和测序确定重组病毒载体pAAV-Rspo1-EGFP构建成功.病毒感染的细胞中检测到绿色荧光,表明重组病毒包装成功并介导融合基因在宿主细胞里表达,病毒滴度达107VP/mL.本研究成功包装出具有侵染性的重组朦相关病毒agV-Rspo1-EGFP,为今后利用腺相关病毒载体进行Rspo1相关的体内体外研究提供了实验基础.
本文通過構建攜帶Rspo1-EGFP融閤基因的重組腺相關病毒載體,包裝齣含有目標基因的重組腺相關病毒.首先利用PCR從cDNA文庫中把Rspo1基因擴增齣來,插入到pcDNA6-EGFP中EGFP的上遊形成融閤基因Rspo1-EGFP.採用AAV Helper-free包裝繫統,將融閤基因用PCR方法從質粒pcDNA6-Rspo1-EGFP上擴增齣來,亞剋隆到AAV錶達質粒pAAV-MCS多剋隆位點中,構建齣重組質粒pAAV-Rspo1-EGFP.重組質粒與包裝質粒pAAV-RC和輔助質粒pHelper燐痠鈣法共轉染AAV-293細胞製備重組病毒rAAV-Rspo1-EGFP.重組病毒感染AAV-HT1080細胞,熒光顯微鏡檢測病毒介導的目標基因錶達,流式細胞技術測定病毒滴度.結果:酶切鑒定和測序確定重組病毒載體pAAV-Rspo1-EGFP構建成功.病毒感染的細胞中檢測到綠色熒光,錶明重組病毒包裝成功併介導融閤基因在宿主細胞裏錶達,病毒滴度達107VP/mL.本研究成功包裝齣具有侵染性的重組朦相關病毒agV-Rspo1-EGFP,為今後利用腺相關病毒載體進行Rspo1相關的體內體外研究提供瞭實驗基礎.
본문통과구건휴대Rspo1-EGFP융합기인적중조선상관병독재체,포장출함유목표기인적중조선상관병독.수선이용PCR종cDNA문고중파Rspo1기인확증출래,삽입도pcDNA6-EGFP중EGFP적상유형성융합기인Rspo1-EGFP.채용AAV Helper-free포장계통,장융합기인용PCR방법종질립pcDNA6-Rspo1-EGFP상확증출래,아극륭도AAV표체질립pAAV-MCS다극륭위점중,구건출중조질립pAAV-Rspo1-EGFP.중조질립여포장질립pAAV-RC화보조질립pHelper린산개법공전염AAV-293세포제비중조병독rAAV-Rspo1-EGFP.중조병독감염AAV-HT1080세포,형광현미경검측병독개도적목표기인표체,류식세포기술측정병독적도.결과:매절감정화측서학정중조병독재체pAAV-Rspo1-EGFP구건성공.병독감염적세포중검측도록색형광,표명중조병독포장성공병개도융합기인재숙주세포리표체,병독적도체107VP/mL.본연구성공포장출구유침염성적중조몽상관병독agV-Rspo1-EGFP,위금후이용선상관병독재체진행Rspo1상관적체내체외연구제공료실험기출.
