中国组织工程研究与临床康复
中國組織工程研究與臨床康複
중국조직공정연구여림상강복
JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH
2009年
41期
8104-8108
,共5页
金旻%谢杨丽%黄炜%杜晓兰%李灿%何启芬%陈林
金旻%謝楊麗%黃煒%杜曉蘭%李燦%何啟芬%陳林
금민%사양려%황위%두효란%리찬%하계분%진림
软骨细胞%细胞培养%关节软骨%分化%小鼠
軟骨細胞%細胞培養%關節軟骨%分化%小鼠
연골세포%세포배양%관절연골%분화%소서
背景:传统培养方法体外培养的软骨细胞经长时间传代培养后往往去分化为成纤维细胞,导致细胞数量及活性下降.如何避免培养过程中的去分化问题,是模拟体内软骨内成骨软骨发育过程的关键.目的:课题创新性提出以Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶结合消化法体外培养扩增C57BL/6小鼠关节软骨细胞并诱导其向更成熟肥大软骨细胞或终末分化软骨细胞分化.设计、时间及地点:细胞学体外观察实验,于2008-09/12在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成.材料:C57BL/6品系新生小鼠9只.方法:采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶结合消化法分离培养C57BL/6新生小鼠关节软骨细胞,细胞计数法绘制细胞生长曲线,RT-PCR检测Ⅱ型胶原进行鉴定.当细胞90%融合时以含5.5mg/L人转铁蛋白,3×10<'-8> mol/L亚硒酸钠,10mg/L牛胰岛素的ITS诱导培养基进行分化诱导.主要观察指标:诱导0,7 d,阿利新蓝染色检测软骨细胞分泌基质中的葡萄糖胺聚糖,von Kossa染色检测软骨细胞钙化结节形成情况,实时定量PCR检测Ⅱ型胶原、X型胶原及基质金属蛋白酶13的表达进行鉴定.结果:原代培养细胞24 h贴壁,呈三角或多角形,培养4～6 d进入快速增殖期,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原的表达,证实获得大量高纯度、高活性的软骨细胞.诱导0 d,细胞单层铺满培养皿底面,无聚集现象;诱导7 d明显可见由软骨细胞聚集形成的软骨小结.与诱导0 d时相比,诱导7 d阿利新蓝染色示软骨细胞分泌基质中的葡萄糖胺聚糖染色呈阳性,可见明显的软骨小结,Ⅱ型胶原及基质金属蛋白酶13表达明显增高,且钙化结节明显增多.结论:采用胰蛋白酶和胶原酶结合消化法获得大量高纯度、高活性的软骨细胞.ITS诱导体系有效地促进了软骨细胞成熟及终末分化,较成功模拟了软骨内成骨的软骨发育过程.
揹景:傳統培養方法體外培養的軟骨細胞經長時間傳代培養後往往去分化為成纖維細胞,導緻細胞數量及活性下降.如何避免培養過程中的去分化問題,是模擬體內軟骨內成骨軟骨髮育過程的關鍵.目的:課題創新性提齣以Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶結閤消化法體外培養擴增C57BL/6小鼠關節軟骨細胞併誘導其嚮更成熟肥大軟骨細胞或終末分化軟骨細胞分化.設計、時間及地點:細胞學體外觀察實驗,于2008-09/12在解放軍第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所全軍戰創傷中心,創傷、燒傷與複閤傷國傢重點實驗室完成.材料:C57BL/6品繫新生小鼠9隻.方法:採用胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶結閤消化法分離培養C57BL/6新生小鼠關節軟骨細胞,細胞計數法繪製細胞生長麯線,RT-PCR檢測Ⅱ型膠原進行鑒定.噹細胞90%融閤時以含5.5mg/L人轉鐵蛋白,3×10<'-8> mol/L亞硒痠鈉,10mg/L牛胰島素的ITS誘導培養基進行分化誘導.主要觀察指標:誘導0,7 d,阿利新藍染色檢測軟骨細胞分泌基質中的葡萄糖胺聚糖,von Kossa染色檢測軟骨細胞鈣化結節形成情況,實時定量PCR檢測Ⅱ型膠原、X型膠原及基質金屬蛋白酶13的錶達進行鑒定.結果:原代培養細胞24 h貼壁,呈三角或多角形,培養4～6 d進入快速增殖期,RT-PCR檢測到Ⅱ型膠原的錶達,證實穫得大量高純度、高活性的軟骨細胞.誘導0 d,細胞單層鋪滿培養皿底麵,無聚集現象;誘導7 d明顯可見由軟骨細胞聚集形成的軟骨小結.與誘導0 d時相比,誘導7 d阿利新藍染色示軟骨細胞分泌基質中的葡萄糖胺聚糖染色呈暘性,可見明顯的軟骨小結,Ⅱ型膠原及基質金屬蛋白酶13錶達明顯增高,且鈣化結節明顯增多.結論:採用胰蛋白酶和膠原酶結閤消化法穫得大量高純度、高活性的軟骨細胞.ITS誘導體繫有效地促進瞭軟骨細胞成熟及終末分化,較成功模擬瞭軟骨內成骨的軟骨髮育過程.
배경:전통배양방법체외배양적연골세포경장시간전대배양후왕왕거분화위성섬유세포,도치세포수량급활성하강.여하피면배양과정중적거분화문제,시모의체내연골내성골연골발육과정적관건.목적:과제창신성제출이Ⅱ형효원매화이단백매결합소화법체외배양확증C57BL/6소서관절연골세포병유도기향경성숙비대연골세포혹종말분화연골세포분화.설계、시간급지점:세포학체외관찰실험,우2008-09/12재해방군제삼군의대학대평의원야전외과연구소전군전창상중심,창상、소상여복합상국가중점실험실완성.재료:C57BL/6품계신생소서9지.방법:채용이단백매화Ⅱ형효원매결합소화법분리배양C57BL/6신생소서관절연골세포,세포계수법회제세포생장곡선,RT-PCR검측Ⅱ형효원진행감정.당세포90%융합시이함5.5mg/L인전철단백,3×10<'-8> mol/L아서산납,10mg/L우이도소적ITS유도배양기진행분화유도.주요관찰지표:유도0,7 d,아리신람염색검측연골세포분비기질중적포도당알취당,von Kossa염색검측연골세포개화결절형성정황,실시정량PCR검측Ⅱ형효원、X형효원급기질금속단백매13적표체진행감정.결과:원대배양세포24 h첩벽,정삼각혹다각형,배양4～6 d진입쾌속증식기,RT-PCR검측도Ⅱ형효원적표체,증실획득대량고순도、고활성적연골세포.유도0 d,세포단층포만배양명저면,무취집현상;유도7 d명현가견유연골세포취집형성적연골소결.여유도0 d시상비,유도7 d아리신람염색시연골세포분비기질중적포도당알취당염색정양성,가견명현적연골소결,Ⅱ형효원급기질금속단백매13표체명현증고,차개화결절명현증다.결론:채용이단백매화효원매결합소화법획득대량고순도、고활성적연골세포.ITS유도체계유효지촉진료연골세포성숙급종말분화,교성공모의료연골내성골적연골발육과정.
