重庆医学
重慶醫學
중경의학
CHONGQING MEDICAL JOURNAL
2012年
20期
2055-2057,2061,封2
,共5页
胡英明%梅晰凡%宋长威%李谌
鬍英明%梅晰凡%宋長威%李諶
호영명%매석범%송장위%리심
锌转运体-1%重组腺病毒,Gateway
鋅轉運體-1%重組腺病毒,Gateway
자전운체-1%중조선병독,Gateway
目的 利用GatewayTM技术构建含大鼠锌转运体1(ZnT1)基因重组腺病毒载体,鉴定外源基因在真核细胞中的良好表达.方法 采用化学合成的方法,合成ZnT1/RES/EGFP目的基因片段,通过PCR方法 在基因片段两端加入attB重组位点,与含有attP重组位点的pDonr221供体载体BP反应形成入门载体pDown-ZnT1.将含有attL重组位点的入门载体与含有attR位点目的载体Ad/CMV/V5-DEST通过LR反应形成腺病毒表达载体pAd-ZnT1.酶切和测序鉴定后,由PacⅠ酶切线性化转染HEK293A细胞包装,提取病毒颗粒.采用终点稀释法测定重组腺病毒滴度;Western blotting技术分析目的 蛋白表达情况.结果 目的 基因按正确的方向重组入克隆载体中,重组腺病毒表达载体在HEK293A细胞中包装成功,获得成熟的腺病毒颗粒,病毒滴度为1.6×108 pfu/L,在HEK293A细胞中高表达.结论 该实验采用GatewayTM技术构建了含有大鼠ZnT1基因的重组腺病毒载体,为下一步研究该基因在脊髓神经细胞中的表达以及与BDNF/TrkB信号调节通路的关系奠定了基础.
目的 利用GatewayTM技術構建含大鼠鋅轉運體1(ZnT1)基因重組腺病毒載體,鑒定外源基因在真覈細胞中的良好錶達.方法 採用化學閤成的方法,閤成ZnT1/RES/EGFP目的基因片段,通過PCR方法 在基因片段兩耑加入attB重組位點,與含有attP重組位點的pDonr221供體載體BP反應形成入門載體pDown-ZnT1.將含有attL重組位點的入門載體與含有attR位點目的載體Ad/CMV/V5-DEST通過LR反應形成腺病毒錶達載體pAd-ZnT1.酶切和測序鑒定後,由PacⅠ酶切線性化轉染HEK293A細胞包裝,提取病毒顆粒.採用終點稀釋法測定重組腺病毒滴度;Western blotting技術分析目的 蛋白錶達情況.結果 目的 基因按正確的方嚮重組入剋隆載體中,重組腺病毒錶達載體在HEK293A細胞中包裝成功,穫得成熟的腺病毒顆粒,病毒滴度為1.6×108 pfu/L,在HEK293A細胞中高錶達.結論 該實驗採用GatewayTM技術構建瞭含有大鼠ZnT1基因的重組腺病毒載體,為下一步研究該基因在脊髓神經細胞中的錶達以及與BDNF/TrkB信號調節通路的關繫奠定瞭基礎.
목적 이용GatewayTM기술구건함대서자전운체1(ZnT1)기인중조선병독재체,감정외원기인재진핵세포중적량호표체.방법 채용화학합성적방법,합성ZnT1/RES/EGFP목적기인편단,통과PCR방법 재기인편단량단가입attB중조위점,여함유attP중조위점적pDonr221공체재체BP반응형성입문재체pDown-ZnT1.장함유attL중조위점적입문재체여함유attR위점목적재체Ad/CMV/V5-DEST통과LR반응형성선병독표체재체pAd-ZnT1.매절화측서감정후,유PacⅠ매절선성화전염HEK293A세포포장,제취병독과립.채용종점희석법측정중조선병독적도;Western blotting기술분석목적 단백표체정황.결과 목적 기인안정학적방향중조입극륭재체중,중조선병독표체재체재HEK293A세포중포장성공,획득성숙적선병독과립,병독적도위1.6×108 pfu/L,재HEK293A세포중고표체.결론 해실험채용GatewayTM기술구건료함유대서ZnT1기인적중조선병독재체,위하일보연구해기인재척수신경세포중적표체이급여BDNF/TrkB신호조절통로적관계전정료기출.
