CAJ | 학술논문

为研究神经元限制性沉默因子(NRSF)负调控神经元及胰岛细胞中神经特异性基因的表达,拟通过RNAi的方法降低NRSF表达以进一步观察其调控的下游基因的表达情况.构建含人胰岛素启动子-荧光素酶(HIP-LUC)的pcDNA3.1报告载体.通过RNAi序列设计软件进行NRSF干涉片段及脱靶对照片段的设计,然后构建慢病毒干涉载体.包装产生慢病毒干涉毒液,用其感染HeLa细胞获得稳定干涉NRSF的细胞株,利用RT-PCR、实时定量PCR、蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色等方法检测NRSF的干涉效果及其下游基因的表达情况,观察干涉NRSF后胰岛素启动子报告载体荧光素酶活性的变化.构建具有NRSF干涉效果的慢病毒干涉载体成功,并获得了稳定干涉NRSF及脱靶对照的HeLa细胞株,RT-PCR及实时定量PCR检测结果表明,NRSF干涉片段的干涉效率为56%(n=6,P<0.01),蛋白质免疫印迹、免疫荧光染色方法检测证实干涉后NRSF蛋白表达水平明显降低.RT-PCR实验表明干涉NRSF后下游基因开始表达,荧光素酶活性分析表明,干涉NRSF后胰岛素启动子活性增强了2.4倍(n=3,P<0.01).上述结果表明,成功构建NRSF的慢病毒干涉载体并获得稳定干涉NRSF的HeLa细胞株,干涉NRSF后,其下游基因特别是胰岛素基因开始表达.这一研究工作有助于我们进一步了解NRSF在胰岛细胞发育分化中的调控作用.
위연구신경원한제성침묵인자(NRSF)부조공신경원급이도세포중신경특이성기인적표체,의통과RNAi적방법강저NRSF표체이진일보관찰기조공적하유기인적표체정황.구건함인이도소계동자-형광소매(HIP-LUC)적pcDNA3.1보고재체.통과RNAi서렬설계연건진행NRSF간섭편단급탈파대조편단적설계,연후구건만병독간섭재체.포장산생만병독간섭독액,용기감염HeLa세포획득은정간섭NRSF적세포주,이용RT-PCR、실시정량PCR、단백질면역인적、면역형광염색등방법검측NRSF적간섭효과급기하유기인적표체정황,관찰간섭NRSF후이도소계동자보고재체형광소매활성적변화.구건구유NRSF간섭효과적만병독간섭재체성공,병획득료은정간섭NRSF급탈파대조적HeLa세포주,RT-PCR급실시정량PCR검측결과표명,NRSF간섭편단적간섭효솔위56%(n=6,P<0.01),단백질면역인적、면역형광염색방법검측증실간섭후NRSF단백표체수평명현강저.RT-PCR실험표명간섭NRSF후하유기인개시표체,형광소매활성분석표명,간섭NRSF후이도소계동자활성증강료2.4배(n=3,P<0.01).상술결과표명,성공구건NRSF적만병독간섭재체병획득은정간섭NRSF적HeLa세포주,간섭NRSF후,기하유기인특별시이도소기인개시표체.저일연구공작유조우아문진일보료해NRSF재이도세포발육분화중적조공작용.