中国水产科学
中國水產科學
중국수산과학
Journal of Fishery Sciences of China
2011年
4期
713-719
,共7页
中华绒螯蟹%罗氏沼虾%cyclin B多克隆抗体%原核表达%卵母细胞成熟
中華絨螯蟹%囉氏沼蝦%cyclin B多剋隆抗體%原覈錶達%卵母細胞成熟
중화융오해%라씨소하%cyclin B다극륭항체%원핵표체%란모세포성숙
从中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)和罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)卵巢cDNA中克隆了cyclin B基因的开放阅读框,分别连接到pGEX-2T和pET-32a表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白GST-EsCB和Trx-MrCB.通过优化培养温度、IPTG浓度以及诱导时间,得出重组蛋白的最佳表达条件分别为:0.1mmol/L IPTG、37℃、4h和0.1 mmol/L IPTG、30℃、6h.重组蛋白主要以包涵体形式存在.亲和层析纯化重组蛋白,作为抗原免疫家兔,制备GST-EsCB和Trx-MrCB多克隆抗体.ELISA检测抗体效价均高达1:80 000,Western blot鉴定该抗体能特异性识别重组蛋白,而且均能够从卵巢总蛋白中检测到cyclin B蛋白.在中华绒螯蟹未成熟卵巢中cyclin B蛋白出现2种亚型,在罗氏沼虾未成熟卵巢中只有1种亚型,推测虾和蟹cyclin B蛋白调控卵母细胞成熟的分子机制不同.本研究制备了cyclin B抗体,旨为在蛋白水平研究cyclin B在卵母细胞成熟过程中的作用机制提供基础条件.
從中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)和囉氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)卵巢cDNA中剋隆瞭cyclin B基因的開放閱讀框,分彆連接到pGEX-2T和pET-32a錶達載體,轉化大腸桿菌BL21(DE3),經IPTG誘導錶達重組蛋白GST-EsCB和Trx-MrCB.通過優化培養溫度、IPTG濃度以及誘導時間,得齣重組蛋白的最佳錶達條件分彆為:0.1mmol/L IPTG、37℃、4h和0.1 mmol/L IPTG、30℃、6h.重組蛋白主要以包涵體形式存在.親和層析純化重組蛋白,作為抗原免疫傢兔,製備GST-EsCB和Trx-MrCB多剋隆抗體.ELISA檢測抗體效價均高達1:80 000,Western blot鑒定該抗體能特異性識彆重組蛋白,而且均能夠從卵巢總蛋白中檢測到cyclin B蛋白.在中華絨螯蟹未成熟卵巢中cyclin B蛋白齣現2種亞型,在囉氏沼蝦未成熟卵巢中隻有1種亞型,推測蝦和蟹cyclin B蛋白調控卵母細胞成熟的分子機製不同.本研究製備瞭cyclin B抗體,旨為在蛋白水平研究cyclin B在卵母細胞成熟過程中的作用機製提供基礎條件.
종중화융오해(Eriocheir sinensis)화라씨소하(Macrobrachium rosenbergii)란소cDNA중극륭료cyclin B기인적개방열독광,분별련접도pGEX-2T화pET-32a표체재체,전화대장간균BL21(DE3),경IPTG유도표체중조단백GST-EsCB화Trx-MrCB.통과우화배양온도、IPTG농도이급유도시간,득출중조단백적최가표체조건분별위:0.1mmol/L IPTG、37℃、4h화0.1 mmol/L IPTG、30℃、6h.중조단백주요이포함체형식존재.친화층석순화중조단백,작위항원면역가토,제비GST-EsCB화Trx-MrCB다극륭항체.ELISA검측항체효개균고체1:80 000,Western blot감정해항체능특이성식별중조단백,이차균능구종란소총단백중검측도cyclin B단백.재중화융오해미성숙란소중cyclin B단백출현2충아형,재라씨소하미성숙란소중지유1충아형,추측하화해cyclin B단백조공란모세포성숙적분자궤제불동.본연구제비료cyclin B항체,지위재단백수평연구cyclin B재란모세포성숙과정중적작용궤제제공기출조건.
