中国医学科学院学报
中國醫學科學院學報
중국의학과학원학보
ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SINICAE
2006年
2期
154-158
,共5页
苏林%刘长征%邓艳春%杨克恭%梁植权%陈松森
囌林%劉長徵%鄧豔春%楊剋恭%樑植權%陳鬆森
소림%류장정%산염춘%양극공%량식권%진송삼
人干细胞因子受体%免疫球蛋白样结构域%his-tag pull-down%酶联免疫结合实验
人榦細胞因子受體%免疫毬蛋白樣結構域%his-tag pull-down%酶聯免疫結閤實驗
인간세포인자수체%면역구단백양결구역%his-tag pull-down%매련면역결합실험
目的在原核和真核细胞中表达人干细胞因子受体(c-Kit)配体结合区膜外N端1～3免疫球蛋白样结构域(c-Kit/Ig1～3),研究其配体结合活性.方法采用重叠延伸PCR定点诱变法合成c-Kit/Ig1～3双突变片段(c-Kit/Ig1～3DM),构建pET16b-c-Kit/Ig1～3DM表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,稀释复性,镍柱纯化.将C端添加组氨酸标签的c-Kit/Ig1～3基因克隆入真核表达载体pEAK12中,转染HEK293 ET细胞构建c-kit/Ig1～3高效表达细胞株,从细胞培养上清中使用镍金属螯合柱收集纯化蛋白.His-tag pull-down和酶联免疫结合实验检测融合蛋白配体结合活性.结果在大肠杆菌中c-Kit/Ig1～3DM以包涵体形式表达,复性后配体结合活性很低.在HEK293 ET细胞中筛选到2个高效表达c-Kit/Ig1～3的细胞株,上清表达量为2μg/ml,融合蛋白相对分子质量为58 000;受体配体结合实验显示真核表达的c-Kit/Ig1～3有明显的干细胞因子特异结合活性,解离常数Kd值为9.39 nmol/L.结论获得了具有较高配体结合活性的c-Kit/Ig1～3融合蛋白.
目的在原覈和真覈細胞中錶達人榦細胞因子受體(c-Kit)配體結閤區膜外N耑1～3免疫毬蛋白樣結構域(c-Kit/Ig1～3),研究其配體結閤活性.方法採用重疊延伸PCR定點誘變法閤成c-Kit/Ig1～3雙突變片段(c-Kit/Ig1～3DM),構建pET16b-c-Kit/Ig1～3DM錶達質粒,轉化E.coli BL21(DE3)誘導錶達,稀釋複性,鎳柱純化.將C耑添加組氨痠標籤的c-Kit/Ig1～3基因剋隆入真覈錶達載體pEAK12中,轉染HEK293 ET細胞構建c-kit/Ig1～3高效錶達細胞株,從細胞培養上清中使用鎳金屬螯閤柱收集純化蛋白.His-tag pull-down和酶聯免疫結閤實驗檢測融閤蛋白配體結閤活性.結果在大腸桿菌中c-Kit/Ig1～3DM以包涵體形式錶達,複性後配體結閤活性很低.在HEK293 ET細胞中篩選到2箇高效錶達c-Kit/Ig1～3的細胞株,上清錶達量為2μg/ml,融閤蛋白相對分子質量為58 000;受體配體結閤實驗顯示真覈錶達的c-Kit/Ig1～3有明顯的榦細胞因子特異結閤活性,解離常數Kd值為9.39 nmol/L.結論穫得瞭具有較高配體結閤活性的c-Kit/Ig1～3融閤蛋白.
목적재원핵화진핵세포중표체인간세포인자수체(c-Kit)배체결합구막외N단1～3면역구단백양결구역(c-Kit/Ig1～3),연구기배체결합활성.방법채용중첩연신PCR정점유변법합성c-Kit/Ig1～3쌍돌변편단(c-Kit/Ig1～3DM),구건pET16b-c-Kit/Ig1～3DM표체질립,전화E.coli BL21(DE3)유도표체,희석복성,얼주순화.장C단첨가조안산표첨적c-Kit/Ig1～3기인극륭입진핵표체재체pEAK12중,전염HEK293 ET세포구건c-kit/Ig1～3고효표체세포주,종세포배양상청중사용얼금속오합주수집순화단백.His-tag pull-down화매련면역결합실험검측융합단백배체결합활성.결과재대장간균중c-Kit/Ig1～3DM이포함체형식표체,복성후배체결합활성흔저.재HEK293 ET세포중사선도2개고효표체c-Kit/Ig1～3적세포주,상청표체량위2μg/ml,융합단백상대분자질량위58 000;수체배체결합실험현시진핵표체적c-Kit/Ig1～3유명현적간세포인자특이결합활성,해리상수Kd치위9.39 nmol/L.결론획득료구유교고배체결합활성적c-Kit/Ig1～3융합단백.
