CAJ | 학술논문

背景:有文献报道应用不同的诱导剂如细胞生长因子和神经营养因子等,可将人脐血单个核细胞体外诱导为神经干细胞和,或成熟神经细胞,但诱导剂的使用方法以及剂量却备不相同.目的:联合应用不同的诱导剂将人脐血单个核细胞体外诱导分化为神经干细胞,并进行形态学观察和鉴定,以确定最佳诱导剂组合及最佳浓度.设计、时间及地点:观察对比实验,于2007-05/2008-09在辽宁省血液中心输血医学研究所细胞研究中心完成.材料:新鲜脐血来源于足月分娩的健康孕妇.方法:体外分离培养人脐血单个核细胞.在无血清DMEM/F12培养液中添加不同组合的诱导因子进行单个核细胞的诱导,以确定最佳诱导因子组合:①10μ g/L神经生长因子(nerve growth factor,NGF)+体积分数为0.01神经营养因子N2+体积分数为0.02神经营养因子B27.⑦10μ g/LNGF+10μ g/L碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)+体积分数为0.01神经营养因子N2+体积分数为0.02神经营养因子B27.③10μ g/L bFGF+10μ g/L表皮生长因子(epidermal growthfactor,EGF)+体积分数为0.01神经营养冈子N2+体积分数为0.02神经营养因子B27.④10μ g/LbFGF+10μ g/L EGF.同时在无血清DMEM/F12培养液中添加不同浓度的bFGF和EGF进行单个核细胞的诱导,以确定最佳诱导浓度:①5μ g/L bFGF+5 μg/LEGF组.②10 μg/LbFGF和10 μg/L EGF组.③20μg/L bFGF和20μg/LEGF组.主要观察指标:①倒置荧光显微镜下观察脐血单个核细胞及各诱导剂组诱导分化为神经丁细胞的形态特征.②免疫荧光检测10 μ g/L bFGF和10μg/L EGF组神经干细胞巢蛋白nestin的表达情况.③流式细胞仪检测10μg/L.bFGF和10μg/L EGF组诱导第7天和第15天的细胞nestin衷达情况.结果:①分离培养的脐血单个核细胞呈散在的圆形牛长.②至诱导第7天,分化细胞出现突触样结构和生长端样结构,并可见多个细胞之间形成网络,符合神经干细胞样形态特征.③不同的细胞因子组合诱导的神经干细胞增殖和分化情况不同,含NGF实验组细胞长势相对最差,含bFGF和EGF实验组的细胞长势最旺盛,胞体较大而圆,细胞突起也粗大,呈三角形或锥形,突触样结构和牛长端样结构明显可见,为最佳诱导因子组合.④010μg/L bFGF+10μ g/L EGF组的细胞密度适中,伸出突起明显,神经细胞形态最特异,培养周期最短,为最适实验浓度.⑤细胞免疫荧光检测10μg/L bFGF+10μ g/L,EGF?组诱导第7天细胞nestin阳性.⑥流式细胞仪分别检测对照组和10μg/L bFGF+10μg/L EGF组诱导第7天、第15天nestin阳性细胞数,差异均具有统计学意义(P<0.05).结论:联合应用 10μ g/L bFGF和10μ g/L EGF可较短时间内定向将人脐血单个核细胞体外诱导分化为神经干细胞. 揹景:有文獻報道應用不同的誘導劑如細胞生長因子和神經營養因子等,可將人臍血單箇覈細胞體外誘導為神經榦細胞和,或成熟神經細胞,但誘導劑的使用方法以及劑量卻備不相同.目的:聯閤應用不同的誘導劑將人臍血單箇覈細胞體外誘導分化為神經榦細胞,併進行形態學觀察和鑒定,以確定最佳誘導劑組閤及最佳濃度.設計、時間及地點:觀察對比實驗,于2007-05/2008-09在遼寧省血液中心輸血醫學研究所細胞研究中心完成.材料:新鮮臍血來源于足月分娩的健康孕婦.方法:體外分離培養人臍血單箇覈細胞.在無血清DMEM/F12培養液中添加不同組閤的誘導因子進行單箇覈細胞的誘導,以確定最佳誘導因子組閤:①10μ g/L神經生長因子(nerve growth factor,NGF)+體積分數為0.01神經營養因子N2+體積分數為0.02神經營養因子B27.⑦10μ g/LNGF+10μ g/L堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)+體積分數為0.01神經營養因子N2+體積分數為0.02神經營養因子B27.③10μ g/L bFGF+10μ g/L錶皮生長因子(epidermal growthfactor,EGF)+體積分數為0.01神經營養岡子N2+體積分數為0.02神經營養因子B27.④10μ g/LbFGF+10μ g/L EGF.同時在無血清DMEM/F12培養液中添加不同濃度的bFGF和EGF進行單箇覈細胞的誘導,以確定最佳誘導濃度:①5μ g/L bFGF+5 μg/LEGF組.②10 μg/LbFGF和10 μg/L EGF組.③20μg/L bFGF和20μg/LEGF組.主要觀察指標:①倒置熒光顯微鏡下觀察臍血單箇覈細胞及各誘導劑組誘導分化為神經丁細胞的形態特徵.②免疫熒光檢測10 μ g/L bFGF和10μg/L EGF組神經榦細胞巢蛋白nestin的錶達情況.③流式細胞儀檢測10μg/L.bFGF和10μg/L EGF組誘導第7天和第15天的細胞nestin衷達情況.結果:①分離培養的臍血單箇覈細胞呈散在的圓形牛長.②至誘導第7天,分化細胞齣現突觸樣結構和生長耑樣結構,併可見多箇細胞之間形成網絡,符閤神經榦細胞樣形態特徵.③不同的細胞因子組閤誘導的神經榦細胞增殖和分化情況不同,含NGF實驗組細胞長勢相對最差,含bFGF和EGF實驗組的細胞長勢最旺盛,胞體較大而圓,細胞突起也粗大,呈三角形或錐形,突觸樣結構和牛長耑樣結構明顯可見,為最佳誘導因子組閤.④010μg/L bFGF+10μ g/L EGF組的細胞密度適中,伸齣突起明顯,神經細胞形態最特異,培養週期最短,為最適實驗濃度.⑤細胞免疫熒光檢測10μg/L bFGF+10μ g/L,EGF?組誘導第7天細胞nestin暘性.⑥流式細胞儀分彆檢測對照組和10μg/L bFGF+10μg/L EGF組誘導第7天、第15天nestin暘性細胞數,差異均具有統計學意義(P<0.05).結論:聯閤應用 10μ g/L bFGF和10μ g/L EGF可較短時間內定嚮將人臍血單箇覈細胞體外誘導分化為神經榦細胞.
배경:유문헌보도응용불동적유도제여세포생장인자화신경영양인자등,가장인제혈단개핵세포체외유도위신경간세포화,혹성숙신경세포,단유도제적사용방법이급제량각비불상동.목적:연합응용불동적유도제장인제혈단개핵세포체외유도분화위신경간세포,병진행형태학관찰화감정,이학정최가유도제조합급최가농도.설계、시간급지점:관찰대비실험,우2007-05/2008-09재요녕성혈액중심수혈의학연구소세포연구중심완성.재료:신선제혈래원우족월분면적건강잉부.방법:체외분리배양인제혈단개핵세포.재무혈청DMEM/F12배양액중첨가불동조합적유도인자진행단개핵세포적유도,이학정최가유도인자조합:①10μ g/L신경생장인자(nerve growth factor,NGF)+체적분수위0.01신경영양인자N2+체적분수위0.02신경영양인자B27.⑦10μ g/LNGF+10μ g/L감성성섬유세포생장인자(basic fibroblast growth factor,bFGF)+체적분수위0.01신경영양인자N2+체적분수위0.02신경영양인자B27.③10μ g/L bFGF+10μ g/L표피생장인자(epidermal growthfactor,EGF)+체적분수위0.01신경영양강자N2+체적분수위0.02신경영양인자B27.④10μ g/LbFGF+10μ g/L EGF.동시재무혈청DMEM/F12배양액중첨가불동농도적bFGF화EGF진행단개핵세포적유도,이학정최가유도농도:①5μ g/L bFGF+5 μg/LEGF조.②10 μg/LbFGF화10 μg/L EGF조.③20μg/L bFGF화20μg/LEGF조.주요관찰지표:①도치형광현미경하관찰제혈단개핵세포급각유도제조유도분화위신경정세포적형태특정.②면역형광검측10 μ g/L bFGF화10μg/L EGF조신경간세포소단백nestin적표체정황.③류식세포의검측10μg/L.bFGF화10μg/L EGF조유도제7천화제15천적세포nestin충체정황.결과:①분리배양적제혈단개핵세포정산재적원형우장.②지유도제7천,분화세포출현돌촉양결구화생장단양결구,병가견다개세포지간형성망락,부합신경간세포양형태특정.③불동적세포인자조합유도적신경간세포증식화분화정황불동,함NGF실험조세포장세상대최차,함bFGF화EGF실험조적세포장세최왕성,포체교대이원,세포돌기야조대,정삼각형혹추형,돌촉양결구화우장단양결구명현가견,위최가유도인자조합.④010μg/L bFGF+10μ g/L EGF조적세포밀도괄중,신출돌기명현,신경세포형태최특이,배양주기최단,위최괄실험농도.⑤세포면역형광검측10μg/L bFGF+10μ g/L,EGF?조유도제7천세포nestin양성.⑥류식세포의분별검측대조조화10μg/L bFGF+10μg/L EGF조유도제7천、제15천nestin양성세포수,차이균구유통계학의의(P<0.05).결론:연합응용 10μ g/L bFGF화10μ g/L EGF가교단시간내정향장인제혈단개핵세포체외유도분화위신경간세포.