中国生物工程杂志
中國生物工程雜誌
중국생물공정잡지
JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY
2008年
5期
78-82
,共5页
周贝贝%李明辉%于雅晴%宋娟%陈光%肖华胜
週貝貝%李明輝%于雅晴%宋娟%陳光%肖華勝
주패패%리명휘%우아청%송연%진광%초화성
甲基化DNA%CpG岛%MBD2b蛋白%亲和层析
甲基化DNA%CpG島%MBD2b蛋白%親和層析
갑기화DNA%CpG도%MBD2b단백%친화층석
高甲基化的CpG岛所致基因表观遗传学转录失活已经成为肿瘤表观基因组学研究的重要内容,但尚未建立一种能快速在全基因组水平上进行甲基化CpG岛的富集方法.利用甲基化结合蛋白MBD2b具有特异性结合甲基化DNA 的特性,建立了一种基于DNA免疫共沉淀技术的全基因组甲基化CpG岛的富集方法.在大肠杆菌中表达重组的GST-MBD2b蛋白,通过Glutathione Sepharose 4B对重组蛋白进行纯化,制备成亲和层析柱,利用在不同的盐离子强度下甲基化DNA和非甲基化DNA的结合能力不同,对甲基化DNA进行富集.用甲基化酶SssI处理过的DNA片段与非甲基化DNA片段进行富条件的摸索,发现0.5mol/L KCl的浓度是甲基化DNA片段和非甲基化DNA片段得以分开的临界条件.样品的富集效率用Real Time PCR进行检测.结果表明,这种方法能够实现对全基因组甲基化DNA的有效富集且最高的富集倍数可达到100 多倍.富集到的甲基化DNA可以进行后续的定量PCR, DNA测序和全基因组芯片的分析等工作,为大规模分析全基因组CpG岛甲基化的改变奠定了基础.
高甲基化的CpG島所緻基因錶觀遺傳學轉錄失活已經成為腫瘤錶觀基因組學研究的重要內容,但尚未建立一種能快速在全基因組水平上進行甲基化CpG島的富集方法.利用甲基化結閤蛋白MBD2b具有特異性結閤甲基化DNA 的特性,建立瞭一種基于DNA免疫共沉澱技術的全基因組甲基化CpG島的富集方法.在大腸桿菌中錶達重組的GST-MBD2b蛋白,通過Glutathione Sepharose 4B對重組蛋白進行純化,製備成親和層析柱,利用在不同的鹽離子彊度下甲基化DNA和非甲基化DNA的結閤能力不同,對甲基化DNA進行富集.用甲基化酶SssI處理過的DNA片段與非甲基化DNA片段進行富條件的摸索,髮現0.5mol/L KCl的濃度是甲基化DNA片段和非甲基化DNA片段得以分開的臨界條件.樣品的富集效率用Real Time PCR進行檢測.結果錶明,這種方法能夠實現對全基因組甲基化DNA的有效富集且最高的富集倍數可達到100 多倍.富集到的甲基化DNA可以進行後續的定量PCR, DNA測序和全基因組芯片的分析等工作,為大規模分析全基因組CpG島甲基化的改變奠定瞭基礎.
고갑기화적CpG도소치기인표관유전학전록실활이경성위종류표관기인조학연구적중요내용,단상미건립일충능쾌속재전기인조수평상진행갑기화CpG도적부집방법.이용갑기화결합단백MBD2b구유특이성결합갑기화DNA 적특성,건립료일충기우DNA면역공침정기술적전기인조갑기화CpG도적부집방법.재대장간균중표체중조적GST-MBD2b단백,통과Glutathione Sepharose 4B대중조단백진행순화,제비성친화층석주,이용재불동적염리자강도하갑기화DNA화비갑기화DNA적결합능력불동,대갑기화DNA진행부집.용갑기화매SssI처리과적DNA편단여비갑기화DNA편단진행부조건적모색,발현0.5mol/L KCl적농도시갑기화DNA편단화비갑기화DNA편단득이분개적림계조건.양품적부집효솔용Real Time PCR진행검측.결과표명,저충방법능구실현대전기인조갑기화DNA적유효부집차최고적부집배수가체도100 다배.부집도적갑기화DNA가이진행후속적정량PCR, DNA측서화전기인조심편적분석등공작,위대규모분석전기인조CpG도갑기화적개변전정료기출.
