CAJ | 학술논문

目的人自身抗原U1RNP 70K通常采用组织提取法或原核表达获得.文中用基因克隆技术,在毕赤酵母中表达人U1RNP 70K自身抗原,并建立斑点免疫金渗滤检测法.方法 PCR扩增U1RNP 70K基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-U1RNP 70K.用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清液用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定.用所表达的蛋白包被硝酸纤维素膜,建立检测U1RNP抗体的斑点免疫金渗滤法(dot immuogold filtrationassay,DIGFA).结果 PCR产物约为1300 bp,接近于预期的1314 bp,pPIC9k-U1RNP 70K重组阳性克隆测序结果与GenBank中的U1RNP 70K序列完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物U1RNP 70K的相对分子质量约70000.Westem blot证实表达产物具有天然U1RNP 70K分子的免疫原性,阴性对照菌无目的条带表达.DIGFA的检测结果与欧蒙酶免疫斑点法的阳性符合率为94.74％( 54/57),阴性符合率为98.00％ (49/50),总符合率为96.26％( 103/107).2种方法检测结果无统计学显著差异(P=0.617).结论在毕赤酵母中成功地高分泌表达了U1RNP 70K蛋白,并建立了简便、快速、准确检测U1RNP抗体的DIGFA方法.
목적 인자신항원U1RNP 70K통상채용조직제취법혹원핵표체획득.문중용기인극륭기술,재필적효모중표체인U1RNP 70K자신항원,병건립반점면역금삼려검측법.방법 PCR확증U1RNP 70K기인,여효모표체재체pPIC9k중조,구건표체질립pPIC9k-U1RNP 70K.용전천공법전화효모균SMD1168,재MD평판상사선중조극륭,용G418쾌속사선고고패전화자,양성극륭경갑순유도표체후,배양상청액용십이완기류산납-취병희선알응효전영(SDS-PAGE)화단백질인적법(Western blot)감정.용소표체적단백포피초산섬유소막,건립검측U1RNP항체적반점면역금삼려법(dot immuogold filtrationassay,DIGFA).결과 PCR산물약위1300 bp,접근우예기적1314 bp,pPIC9k-U1RNP 70K중조양성극륭측서결과여GenBank중적U1RNP 70K서렬완전일치,쌍매절감정정학,표체산물U1RNP 70K적상대분자질량약70000.Westem blot증실표체산물구유천연U1RNP 70K분자적면역원성,음성대조균무목적조대표체.DIGFA적검측결과여구몽매면역반점법적양성부합솔위94.74％( 54/57),음성부합솔위98.00％ (49/50),총부합솔위96.26％( 103/107).2충방법검측결과무통계학현저차이(P=0.617).결론 재필적효모중성공지고분비표체료U1RNP 70K단백,병건립료간편、쾌속、준학검측U1RNP항체적DIGFA방법.