基因组学与应用生物学
基因組學與應用生物學
기인조학여응용생물학
GENOMICS AND APPLIED BIOLOGY
2010年
6期
1072-1077
,共6页
林湛松%王健华%张雨良%江林%杨文君%余乃通%刘志昕
林湛鬆%王健華%張雨良%江林%楊文君%餘迺通%劉誌昕
림담송%왕건화%장우량%강림%양문군%여내통%류지흔
香蕉条斑病毒%原核表达%细菌双杂交%Western blotting%自激活鉴定
香蕉條斑病毒%原覈錶達%細菌雙雜交%Western blotting%自激活鑒定
향초조반병독%원핵표체%세균쌍잡교%Western blotting%자격활감정
目前,香蕉条斑病毒所有3个ORF表达产物功能均不明确,通过双杂技术研究病毒未知蛋白与宿主蛋白的互作,可以初步推断未知蛋白的功能.本实验旨在构建香蕉条斑病毒ORF Ⅰ和ORFⅡ在细菌双杂系统中的诱饵质粒.首先以课题组保存的连接有香蕉条斑病毒河口分离物全基因组的pMD-18T载体DNA为模板,经过PCR扩增,切胶回收,并通过与带有λcI基因的pBT载体共同双酶切及T4连接酶连接后,得到与λcI基因融合表达的重组载体pBT-ORF1和pBT-ORF2.转化大肠杆菌XL1-Blue MRF'报告菌株,用IPTG(0.1 mmol/L)诱导目的基因片段表达.Westernblotting结果表明,ORF1-λcI和ORF1-λcI两种融合蛋白均成功表达,且大小与预期一致.之后,pBT-ORF1及pBT-ORF2分别与空质粒pTRG共转化XL1-Blue MRF'报告菌株,pBT空质粒和pTRG-Gal11p共转化作为阴性对照.结果显示pBT-ORF1及pBT-ORF2均无自激活现象,可以进行后续的细菌双杂工作.本实验为BSV与宿主的细菌双杂系统的建立及蛋白组学的研究奠定了基础.
目前,香蕉條斑病毒所有3箇ORF錶達產物功能均不明確,通過雙雜技術研究病毒未知蛋白與宿主蛋白的互作,可以初步推斷未知蛋白的功能.本實驗旨在構建香蕉條斑病毒ORF Ⅰ和ORFⅡ在細菌雙雜繫統中的誘餌質粒.首先以課題組保存的連接有香蕉條斑病毒河口分離物全基因組的pMD-18T載體DNA為模闆,經過PCR擴增,切膠迴收,併通過與帶有λcI基因的pBT載體共同雙酶切及T4連接酶連接後,得到與λcI基因融閤錶達的重組載體pBT-ORF1和pBT-ORF2.轉化大腸桿菌XL1-Blue MRF'報告菌株,用IPTG(0.1 mmol/L)誘導目的基因片段錶達.Westernblotting結果錶明,ORF1-λcI和ORF1-λcI兩種融閤蛋白均成功錶達,且大小與預期一緻.之後,pBT-ORF1及pBT-ORF2分彆與空質粒pTRG共轉化XL1-Blue MRF'報告菌株,pBT空質粒和pTRG-Gal11p共轉化作為陰性對照.結果顯示pBT-ORF1及pBT-ORF2均無自激活現象,可以進行後續的細菌雙雜工作.本實驗為BSV與宿主的細菌雙雜繫統的建立及蛋白組學的研究奠定瞭基礎.
목전,향초조반병독소유3개ORF표체산물공능균불명학,통과쌍잡기술연구병독미지단백여숙주단백적호작,가이초보추단미지단백적공능.본실험지재구건향초조반병독ORF Ⅰ화ORFⅡ재세균쌍잡계통중적유이질립.수선이과제조보존적련접유향초조반병독하구분리물전기인조적pMD-18T재체DNA위모판,경과PCR확증,절효회수,병통과여대유λcI기인적pBT재체공동쌍매절급T4련접매련접후,득도여λcI기인융합표체적중조재체pBT-ORF1화pBT-ORF2.전화대장간균XL1-Blue MRF'보고균주,용IPTG(0.1 mmol/L)유도목적기인편단표체.Westernblotting결과표명,ORF1-λcI화ORF1-λcI량충융합단백균성공표체,차대소여예기일치.지후,pBT-ORF1급pBT-ORF2분별여공질립pTRG공전화XL1-Blue MRF'보고균주,pBT공질립화pTRG-Gal11p공전화작위음성대조.결과현시pBT-ORF1급pBT-ORF2균무자격활현상,가이진행후속적세균쌍잡공작.본실험위BSV여숙주적세균쌍잡계통적건립급단백조학적연구전정료기출.
