海军总医院学报
海軍總醫院學報
해군총의원학보
JOURNAL OF NAVAL GENERAL HOSPITAL
2010年
2期
65-69
,共5页
姚合斌%高荣凯%王晓英%黄火高%乔媛媛%尚健%尹义存
姚閤斌%高榮凱%王曉英%黃火高%喬媛媛%尚健%尹義存
요합빈%고영개%왕효영%황화고%교원원%상건%윤의존
Cchl1a3基因%低血钾%打靶载体%基因敲入%同源重组
Cchl1a3基因%低血鉀%打靶載體%基因敲入%同源重組
Cchl1a3기인%저혈갑%타파재체%기인고입%동원중조
目的 构建小鼠Cchl1a3基因R528H突变型基因敲入打靶载体,模仿低血钾周期性麻痹患者中的对应发现.方法 采用置换型载体,分为长短、短臂设计(1.5～2.0 kb),以便用聚合酶链反应(PCR)方法筛选中靶载体和ES细胞(embrgonic stem cell).首先以Cchl1a3基因为模板设计引物,并引入与质粒内插入位点酶切序列相配的内切酶序列,扩增用于套取的同源臂a和b,以及用于插入筛选基因和实行定点突变的同源臂c和d,c和d首尾相接,用点突变特异性PCR在c内实现R528H突变.将a和b定向插入pBR322,借助于温度敏感的pSC101-BAD-gba-(tet)质粒的表达Red/ET重组酶,使其与携带Cchl1a3基因的细菌人工染色体(BAC)实现同源重组,套取含目的突变点、长约8 kb的Cchl1a3的基因片断,形成pBR322-Cchl1a3.将c和d定向插入PL451质粒Frt-Neo-Frt片段两侧,酶切c-Frt-Neo-Frt-d片断纯化后,再与pBR322-Cchl1a3质粒一同转入含Red/ET重组酶基因的大肠杆菌EL250菌株,在重组酶的催化下再次实现同源重组,在Cchl1a3基因的给定位点实现R528H突变并插入包含筛选基因和重组酶识别位点的Frt-Neo-Frt片断,完成载体的构建.载体构建过程中,酶切位点变化导致的片断程度改变作为初筛,PCR产物测序结果作为最后的鉴定依据.结果 打靶载体符合设计要求.结论 运用点突变特异性PCR,结合Red/ET重组技术构建基因定点突变的基因敲入型打靶载体,在重组酶催化下仅需要2次同源重组即可完成.该策略成熟简便,省时省力,构建的载体易于鉴定.
目的 構建小鼠Cchl1a3基因R528H突變型基因敲入打靶載體,模倣低血鉀週期性痳痺患者中的對應髮現.方法 採用置換型載體,分為長短、短臂設計(1.5～2.0 kb),以便用聚閤酶鏈反應(PCR)方法篩選中靶載體和ES細胞(embrgonic stem cell).首先以Cchl1a3基因為模闆設計引物,併引入與質粒內插入位點酶切序列相配的內切酶序列,擴增用于套取的同源臂a和b,以及用于插入篩選基因和實行定點突變的同源臂c和d,c和d首尾相接,用點突變特異性PCR在c內實現R528H突變.將a和b定嚮插入pBR322,藉助于溫度敏感的pSC101-BAD-gba-(tet)質粒的錶達Red/ET重組酶,使其與攜帶Cchl1a3基因的細菌人工染色體(BAC)實現同源重組,套取含目的突變點、長約8 kb的Cchl1a3的基因片斷,形成pBR322-Cchl1a3.將c和d定嚮插入PL451質粒Frt-Neo-Frt片段兩側,酶切c-Frt-Neo-Frt-d片斷純化後,再與pBR322-Cchl1a3質粒一同轉入含Red/ET重組酶基因的大腸桿菌EL250菌株,在重組酶的催化下再次實現同源重組,在Cchl1a3基因的給定位點實現R528H突變併插入包含篩選基因和重組酶識彆位點的Frt-Neo-Frt片斷,完成載體的構建.載體構建過程中,酶切位點變化導緻的片斷程度改變作為初篩,PCR產物測序結果作為最後的鑒定依據.結果 打靶載體符閤設計要求.結論 運用點突變特異性PCR,結閤Red/ET重組技術構建基因定點突變的基因敲入型打靶載體,在重組酶催化下僅需要2次同源重組即可完成.該策略成熟簡便,省時省力,構建的載體易于鑒定.
목적 구건소서Cchl1a3기인R528H돌변형기인고입타파재체,모방저혈갑주기성마비환자중적대응발현.방법 채용치환형재체,분위장단、단비설계(1.5～2.0 kb),이편용취합매련반응(PCR)방법사선중파재체화ES세포(embrgonic stem cell).수선이Cchl1a3기인위모판설계인물,병인입여질립내삽입위점매절서렬상배적내절매서렬,확증용우투취적동원비a화b,이급용우삽입사선기인화실행정점돌변적동원비c화d,c화d수미상접,용점돌변특이성PCR재c내실현R528H돌변.장a화b정향삽입pBR322,차조우온도민감적pSC101-BAD-gba-(tet)질립적표체Red/ET중조매,사기여휴대Cchl1a3기인적세균인공염색체(BAC)실현동원중조,투취함목적돌변점、장약8 kb적Cchl1a3적기인편단,형성pBR322-Cchl1a3.장c화d정향삽입PL451질립Frt-Neo-Frt편단량측,매절c-Frt-Neo-Frt-d편단순화후,재여pBR322-Cchl1a3질립일동전입함Red/ET중조매기인적대장간균EL250균주,재중조매적최화하재차실현동원중조,재Cchl1a3기인적급정위점실현R528H돌변병삽입포함사선기인화중조매식별위점적Frt-Neo-Frt편단,완성재체적구건.재체구건과정중,매절위점변화도치적편단정도개변작위초사,PCR산물측서결과작위최후적감정의거.결과 타파재체부합설계요구.결론 운용점돌변특이성PCR,결합Red/ET중조기술구건기인정점돌변적기인고입형타파재체,재중조매최화하부수요2차동원중조즉가완성.해책략성숙간편,성시성력,구건적재체역우감정.
