兰州大学学报（医学版）
蘭州大學學報（醫學版）
란주대학학보（의학판）
JOURNAL OF LANZHOU UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES)
2007年
3期
12-16
,共5页
杨霄鹏%郭建巍%吕同德%范兰芳
楊霄鵬%郭建巍%呂同德%範蘭芳
양소붕%곽건외%려동덕%범란방
生物素%基因%融合表达%纯化
生物素%基因%融閤錶達%純化
생물소%기인%융합표체%순화
目的 构建生物素原核表达载体,获取同源性、可溶性、高纯度的重组生物素融合蛋白,为生物素的深入研究及肿瘤的早期诊断奠定基础.方法 从胃癌细胞中提取RNA,经RT-PCR扩增,克隆出生物素基因;用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ对生物素DNA和载体pET32进行双酶切,构建pET32-生物素重组质粒;将重组质粒转化BL21感受态细胞,通过氨苄青霉素抗性、PCR和重组质粒双酶切筛选重组子转化菌落,经DNA测序及BLAST比对,确认生物素基因序列正确性以及插入pET32质粒的位点和方向;用IPTG诱导表达,Western-Blotting鉴定,用Ni2+金属螯合层析柱纯化重组融合蛋白.结果 通过RT-PCR,经1%的琼脂糖凝胶电泳检测,扩增的生物素DNA片段与预期大小一致.经双酶切及DNA测序鉴定,生物素DNA定向插入了pET32质粒.用重组质粒转化大肠杆菌BL21、诱导表达和纯化目的蛋白.经Western-Blotting鉴定,所诱导的蛋白为重组生物素融合蛋白.结论 成功构建了生物素基因原核表达载体,表达和纯化了生物素融合蛋白.
目的 構建生物素原覈錶達載體,穫取同源性、可溶性、高純度的重組生物素融閤蛋白,為生物素的深入研究及腫瘤的早期診斷奠定基礎.方法 從胃癌細胞中提取RNA,經RT-PCR擴增,剋隆齣生物素基因;用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ對生物素DNA和載體pET32進行雙酶切,構建pET32-生物素重組質粒;將重組質粒轉化BL21感受態細胞,通過氨芐青黴素抗性、PCR和重組質粒雙酶切篩選重組子轉化菌落,經DNA測序及BLAST比對,確認生物素基因序列正確性以及插入pET32質粒的位點和方嚮;用IPTG誘導錶達,Western-Blotting鑒定,用Ni2+金屬螯閤層析柱純化重組融閤蛋白.結果 通過RT-PCR,經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,擴增的生物素DNA片段與預期大小一緻.經雙酶切及DNA測序鑒定,生物素DNA定嚮插入瞭pET32質粒.用重組質粒轉化大腸桿菌BL21、誘導錶達和純化目的蛋白.經Western-Blotting鑒定,所誘導的蛋白為重組生物素融閤蛋白.結論 成功構建瞭生物素基因原覈錶達載體,錶達和純化瞭生物素融閤蛋白.
목적 구건생물소원핵표체재체,획취동원성、가용성、고순도적중조생물소융합단백,위생물소적심입연구급종류적조기진단전정기출.방법 종위암세포중제취RNA,경RT-PCR확증,극륭출생물소기인;용BamH Ⅰ화Hind Ⅲ대생물소DNA화재체pET32진행쌍매절,구건pET32-생물소중조질립;장중조질립전화BL21감수태세포,통과안변청매소항성、PCR화중조질립쌍매절사선중조자전화균락,경DNA측서급BLAST비대,학인생물소기인서렬정학성이급삽입pET32질립적위점화방향;용IPTG유도표체,Western-Blotting감정,용Ni2+금속오합층석주순화중조융합단백.결과 통과RT-PCR,경1%적경지당응효전영검측,확증적생물소DNA편단여예기대소일치.경쌍매절급DNA측서감정,생물소DNA정향삽입료pET32질립.용중조질립전화대장간균BL21、유도표체화순화목적단백.경Western-Blotting감정,소유도적단백위중조생물소융합단백.결론 성공구건료생물소기인원핵표체재체,표체화순화료생물소융합단백.
