南京大学学报(自然科学版)
南京大學學報(自然科學版)
남경대학학보(자연과학판)
JOURNAL OF NANJING UNIVERSITY
2001年
5期
542-550
,共9页
薛宇鸣%程霓%吴春雷%李烨%张敏跃
薛宇鳴%程霓%吳春雷%李燁%張敏躍
설우명%정예%오춘뢰%리엽%장민약
α-乳清蛋白,溶菌酶,合成底物p-Nitrophenyl-β-DN',N",N"'-Triacetyl-chitotriose [pNP-(NAcGlc)3],等温滴定量热法
α-乳清蛋白,溶菌酶,閤成底物p-Nitrophenyl-β-DN',N",N"'-Triacetyl-chitotriose [pNP-(NAcGlc)3],等溫滴定量熱法
α-유청단백,용균매,합성저물p-Nitrophenyl-β-DN',N",N"'-Triacetyl-chitotriose [pNP-(NAcGlc)3],등온적정량열법
在溶菌酶催化机理以及α-乳清蛋白和溶菌酶同源比较的基础上,构建了含3个突变点的α-乳清蛋白突变体(H32L,T33E,Y103A),并将其克隆到具有T7启动子的表达质粒pET28a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)/pLys中获得高效表达.存在于包涵体中的目标蛋白经变复性并通过DEAE Sepharose Streamline和Sephacryl S200层析柱获得纯化蛋白.合成底物p-Nitrophenyl-β-D-N',N",N"'-Triacetyl-chitotriose[pNP-(NAcGlc)3]与突变体蛋白的反应时间曲线证明突变体蛋白获得了部分溶菌酶生物活性,为重组鸡蛋清溶菌酶(HEWL)的5.26%.利用等温滴定量热法测定突变体蛋白与五糖底物chitopentaose的平均热结合能为71.34kJ/mol,重组HEWL为105.47kJ/mol.实验表明,通过有限的几个突变就可以使α-乳清蛋白获得溶菌酶的活性,这在分子水平上有力地佐证了两者的高度同源性和进化关系.
在溶菌酶催化機理以及α-乳清蛋白和溶菌酶同源比較的基礎上,構建瞭含3箇突變點的α-乳清蛋白突變體(H32L,T33E,Y103A),併將其剋隆到具有T7啟動子的錶達質粒pET28a(+)中,在大腸桿菌BL21(DE3)/pLys中穫得高效錶達.存在于包涵體中的目標蛋白經變複性併通過DEAE Sepharose Streamline和Sephacryl S200層析柱穫得純化蛋白.閤成底物p-Nitrophenyl-β-D-N',N",N"'-Triacetyl-chitotriose[pNP-(NAcGlc)3]與突變體蛋白的反應時間麯線證明突變體蛋白穫得瞭部分溶菌酶生物活性,為重組鷄蛋清溶菌酶(HEWL)的5.26%.利用等溫滴定量熱法測定突變體蛋白與五糖底物chitopentaose的平均熱結閤能為71.34kJ/mol,重組HEWL為105.47kJ/mol.實驗錶明,通過有限的幾箇突變就可以使α-乳清蛋白穫得溶菌酶的活性,這在分子水平上有力地佐證瞭兩者的高度同源性和進化關繫.
재용균매최화궤리이급α-유청단백화용균매동원비교적기출상,구건료함3개돌변점적α-유청단백돌변체(H32L,T33E,Y103A),병장기극륭도구유T7계동자적표체질립pET28a(+)중,재대장간균BL21(DE3)/pLys중획득고효표체.존재우포함체중적목표단백경변복성병통과DEAE Sepharose Streamline화Sephacryl S200층석주획득순화단백.합성저물p-Nitrophenyl-β-D-N',N",N"'-Triacetyl-chitotriose[pNP-(NAcGlc)3]여돌변체단백적반응시간곡선증명돌변체단백획득료부분용균매생물활성,위중조계단청용균매(HEWL)적5.26%.이용등온적정량열법측정돌변체단백여오당저물chitopentaose적평균열결합능위71.34kJ/mol,중조HEWL위105.47kJ/mol.실험표명,통과유한적궤개돌변취가이사α-유청단백획득용균매적활성,저재분자수평상유력지좌증료량자적고도동원성화진화관계.
