中国修复重建外科杂志
中國脩複重建外科雜誌
중국수복중건외과잡지
CHINESE JOURNAL OF REPARATIVE AND RECONSTRUCTIVE SURGERY
2008年
2期
157-162
,共6页
付勤%于冬冬%王勇%付永慧%宫树一
付勤%于鼕鼕%王勇%付永慧%宮樹一
부근%우동동%왕용%부영혜%궁수일
软骨组织工程%BMSCs%基因转染%TGF-β1%IGF-1%大鼠
軟骨組織工程%BMSCs%基因轉染%TGF-β1%IGF-1%大鼠
연골조직공정%BMSCs%기인전염%TGF-β1%IGF-1%대서
目的 探讨应用TGF-β1和IGF-1基因转染大鼠BMSCs后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果,为构建新型的组织工程软骨种子细胞提供思路. 方法 6周龄健康雄性Wistar大鼠2只,体重约150 g.扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-TGF-β1,酶切、电泳鉴定并测序.采用密度梯度离心法和贴壁分离法,分离、纯化Wistar大鼠BMSCs,倒置相差显微镜观察原代和传代BMSCs形态学改变,免疫荧光法检测细胞表面标志.将TGF-β1和IGF-1基因单独或共转染第3代BMSCs,按转染情况分为5组:未转染组(A组)、转染空载体组(B组)、转染TGF-β1组(C组)、转染IGF-1组(D组)、TGF-β1与IGF-1共转染组(E组).对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,RT-PCR和Western blot法检测筛选后细胞的表达. 结果 电泳显示IGF-1和TGF-β1两目的基因条带,基因测序与Gene-Bank cDNA序列相符.大鼠BMSCs原代细胞接种24 h后可见少量贴壁突起细胞,4、5 d开始形成典型的BMSCs簇状增生,9、10 d细胞生长即可达80%～90%融合;传代后细胞形态较均一.免疫荧光法检测BMSCs的CD29、CD44呈阳性反应,CD34、CD45呈阴性反应.转染24 h后有少量细胞死亡,筛选3周后细胞克隆形成,至第4周细胞可传代,多数细胞变成多边形,部分细胞边界不清,呈圆形,核偏位,核周颗粒明显.MTT法测定A、B、C、D、E组细胞在490 nm波长处的吸光度(A)值,分别为0.432±0.038、0.428±0.041、0.664±0.086、0.655 ±0.045和0.833 ±0.103.A、B组与C、D、E组间差异均有统计学意义(P＜0.01),但A、B组以及C、D、E组间差异无统计学意义(P＞0.05).RT-PCR和Westernblot检测目的基因和蛋白的表达量,TGF-β1表达以C组最多,分别为0.925 ±0.0220、124.341 7 ±2.982 0,E组次之,分别为0.771 7±0.012 0、101.766 7±1.241 0(P＜0.01);IGF-1表达以E组最多,分别为1.0200±0.026 0、128.171 7±9.152 0,D组次之,分别为0.465 0 ±0.042 0、111.045 0 ±6.248 0(P＜0.01);Ⅱ型胶原表达以E组最多,分别为0.980 0 ±0.034 0、120.355 0 ±12.550 0,C组次之,分别为0.720 0 ±0.026 0、72.246 7 ±7.364 0(P＜0.01). 结论 通过TGF-β1和IGF-1基因共同转染BMSCs修复软骨缺损是一个较有前景的发展方向,对组织工程软骨应用于临床具有重要意义.
目的 探討應用TGF-β1和IGF-1基因轉染大鼠BMSCs後,目的基因分泌情況及嚮軟骨細胞的分化效果,為構建新型的組織工程軟骨種子細胞提供思路. 方法 6週齡健康雄性Wistar大鼠2隻,體重約150 g.擴增、提取質粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-TGF-β1,酶切、電泳鑒定併測序.採用密度梯度離心法和貼壁分離法,分離、純化Wistar大鼠BMSCs,倒置相差顯微鏡觀察原代和傳代BMSCs形態學改變,免疫熒光法檢測細胞錶麵標誌.將TGF-β1和IGF-1基因單獨或共轉染第3代BMSCs,按轉染情況分為5組:未轉染組(A組)、轉染空載體組(B組)、轉染TGF-β1組(C組)、轉染IGF-1組(D組)、TGF-β1與IGF-1共轉染組(E組).對轉染後細胞進行篩選,MTT法測定篩選後細胞的增殖活性,RT-PCR和Western blot法檢測篩選後細胞的錶達. 結果 電泳顯示IGF-1和TGF-β1兩目的基因條帶,基因測序與Gene-Bank cDNA序列相符.大鼠BMSCs原代細胞接種24 h後可見少量貼壁突起細胞,4、5 d開始形成典型的BMSCs簇狀增生,9、10 d細胞生長即可達80%～90%融閤;傳代後細胞形態較均一.免疫熒光法檢測BMSCs的CD29、CD44呈暘性反應,CD34、CD45呈陰性反應.轉染24 h後有少量細胞死亡,篩選3週後細胞剋隆形成,至第4週細胞可傳代,多數細胞變成多邊形,部分細胞邊界不清,呈圓形,覈偏位,覈週顆粒明顯.MTT法測定A、B、C、D、E組細胞在490 nm波長處的吸光度(A)值,分彆為0.432±0.038、0.428±0.041、0.664±0.086、0.655 ±0.045和0.833 ±0.103.A、B組與C、D、E組間差異均有統計學意義(P＜0.01),但A、B組以及C、D、E組間差異無統計學意義(P＞0.05).RT-PCR和Westernblot檢測目的基因和蛋白的錶達量,TGF-β1錶達以C組最多,分彆為0.925 ±0.0220、124.341 7 ±2.982 0,E組次之,分彆為0.771 7±0.012 0、101.766 7±1.241 0(P＜0.01);IGF-1錶達以E組最多,分彆為1.0200±0.026 0、128.171 7±9.152 0,D組次之,分彆為0.465 0 ±0.042 0、111.045 0 ±6.248 0(P＜0.01);Ⅱ型膠原錶達以E組最多,分彆為0.980 0 ±0.034 0、120.355 0 ±12.550 0,C組次之,分彆為0.720 0 ±0.026 0、72.246 7 ±7.364 0(P＜0.01). 結論 通過TGF-β1和IGF-1基因共同轉染BMSCs脩複軟骨缺損是一箇較有前景的髮展方嚮,對組織工程軟骨應用于臨床具有重要意義.
목적 탐토응용TGF-β1화IGF-1기인전염대서BMSCs후,목적기인분비정황급향연골세포적분화효과,위구건신형적조직공정연골충자세포제공사로. 방법 6주령건강웅성Wistar대서2지,체중약150 g.확증、제취질립pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-TGF-β1,매절、전영감정병측서.채용밀도제도리심법화첩벽분리법,분리、순화Wistar대서BMSCs,도치상차현미경관찰원대화전대BMSCs형태학개변,면역형광법검측세포표면표지.장TGF-β1화IGF-1기인단독혹공전염제3대BMSCs,안전염정황분위5조:미전염조(A조)、전염공재체조(B조)、전염TGF-β1조(C조)、전염IGF-1조(D조)、TGF-β1여IGF-1공전염조(E조).대전염후세포진행사선,MTT법측정사선후세포적증식활성,RT-PCR화Western blot법검측사선후세포적표체. 결과 전영현시IGF-1화TGF-β1량목적기인조대,기인측서여Gene-Bank cDNA서렬상부.대서BMSCs원대세포접충24 h후가견소량첩벽돌기세포,4、5 d개시형성전형적BMSCs족상증생,9、10 d세포생장즉가체80%～90%융합;전대후세포형태교균일.면역형광법검측BMSCs적CD29、CD44정양성반응,CD34、CD45정음성반응.전염24 h후유소량세포사망,사선3주후세포극륭형성,지제4주세포가전대,다수세포변성다변형,부분세포변계불청,정원형,핵편위,핵주과립명현.MTT법측정A、B、C、D、E조세포재490 nm파장처적흡광도(A)치,분별위0.432±0.038、0.428±0.041、0.664±0.086、0.655 ±0.045화0.833 ±0.103.A、B조여C、D、E조간차이균유통계학의의(P＜0.01),단A、B조이급C、D、E조간차이무통계학의의(P＞0.05).RT-PCR화Westernblot검측목적기인화단백적표체량,TGF-β1표체이C조최다,분별위0.925 ±0.0220、124.341 7 ±2.982 0,E조차지,분별위0.771 7±0.012 0、101.766 7±1.241 0(P＜0.01);IGF-1표체이E조최다,분별위1.0200±0.026 0、128.171 7±9.152 0,D조차지,분별위0.465 0 ±0.042 0、111.045 0 ±6.248 0(P＜0.01);Ⅱ형효원표체이E조최다,분별위0.980 0 ±0.034 0、120.355 0 ±12.550 0,C조차지,분별위0.720 0 ±0.026 0、72.246 7 ±7.364 0(P＜0.01). 결론 통과TGF-β1화IGF-1기인공동전염BMSCs수복연골결손시일개교유전경적발전방향,대조직공정연골응용우림상구유중요의의.
