安徽医科大学学报
安徽醫科大學學報
안휘의과대학학보
ACTA UNIVERSITY MEDICINALIS ANHUI
2012年
8期
895-899
,共5页
赵秀玲%张梅%何金生%付远辉
趙秀玲%張梅%何金生%付遠輝
조수령%장매%하금생%부원휘
人呼吸道合胞病毒%核蛋白%磷蛋白%转录延长/终止抑制因子M2-1%大蛋白
人呼吸道閤胞病毒%覈蛋白%燐蛋白%轉錄延長/終止抑製因子M2-1%大蛋白
인호흡도합포병독%핵단백%린단백%전록연장/종지억제인자M2-1%대단백
目的 构建可表达人呼吸道合胞病毒(RSV)转录延长/终止抑制因子M2-1(简称M2-1)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)的真核表达载体并鉴定蛋白表达情况.方法 采用合成T7启动子Oligo DNA及PCR方法获得含有T7启动子的表达盒,通过体外连接方法克隆入载体px8δT,制备表达载体px8δT-PT.设计3对PCR引物,PCR扩增出RSV的M2-1、N和P基因,并克隆至px8δT-PT,构建px8δT-PT-M2-1、px8δT-PT-N和px8δT-PT-P.同时利用已有的质粒pcDNA3.1-L构建px8δT-PT-L.用重组质粒转染 BSR T7/5细胞,72 h后再用Western blot法鉴定蛋白的表达.结果 成功实现px8δT的改造,构建的4种重组质粒px8δT-PT-M2-1、px8δT-PT-N、px8δT-PT-P和px8δT-PT-L,经限制性内切酶分析与预期一致,经Western blot法分析证实M2-1、N及P蛋白被表达.结论 获得以T7为启动子的表达载体px8δT-P,成功构建了含有M2-1、N及P编码基因的表达载体,为利用反向遗传学技术进一步改造RSV奠定了基础.
目的 構建可錶達人呼吸道閤胞病毒(RSV)轉錄延長/終止抑製因子M2-1(簡稱M2-1)、覈蛋白(N)、燐蛋白(P)和大蛋白(L)的真覈錶達載體併鑒定蛋白錶達情況.方法 採用閤成T7啟動子Oligo DNA及PCR方法穫得含有T7啟動子的錶達盒,通過體外連接方法剋隆入載體px8δT,製備錶達載體px8δT-PT.設計3對PCR引物,PCR擴增齣RSV的M2-1、N和P基因,併剋隆至px8δT-PT,構建px8δT-PT-M2-1、px8δT-PT-N和px8δT-PT-P.同時利用已有的質粒pcDNA3.1-L構建px8δT-PT-L.用重組質粒轉染 BSR T7/5細胞,72 h後再用Western blot法鑒定蛋白的錶達.結果 成功實現px8δT的改造,構建的4種重組質粒px8δT-PT-M2-1、px8δT-PT-N、px8δT-PT-P和px8δT-PT-L,經限製性內切酶分析與預期一緻,經Western blot法分析證實M2-1、N及P蛋白被錶達.結論 穫得以T7為啟動子的錶達載體px8δT-P,成功構建瞭含有M2-1、N及P編碼基因的錶達載體,為利用反嚮遺傳學技術進一步改造RSV奠定瞭基礎.
목적 구건가표체인호흡도합포병독(RSV)전록연장/종지억제인자M2-1(간칭M2-1)、핵단백(N)、린단백(P)화대단백(L)적진핵표체재체병감정단백표체정황.방법 채용합성T7계동자Oligo DNA급PCR방법획득함유T7계동자적표체합,통과체외련접방법극륭입재체px8δT,제비표체재체px8δT-PT.설계3대PCR인물,PCR확증출RSV적M2-1、N화P기인,병극륭지px8δT-PT,구건px8δT-PT-M2-1、px8δT-PT-N화px8δT-PT-P.동시이용이유적질립pcDNA3.1-L구건px8δT-PT-L.용중조질립전염 BSR T7/5세포,72 h후재용Western blot법감정단백적표체.결과 성공실현px8δT적개조,구건적4충중조질립px8δT-PT-M2-1、px8δT-PT-N、px8δT-PT-P화px8δT-PT-L,경한제성내절매분석여예기일치,경Western blot법분석증실M2-1、N급P단백피표체.결론 획득이T7위계동자적표체재체px8δT-P,성공구건료함유M2-1、N급P편마기인적표체재체,위이용반향유전학기술진일보개조RSV전정료기출.
