CAJ | 학술논문

为了获得具有生物活性的拟南芥(Arabidopsis thaliana)alpha-dioxygenase 2(AtOOX2),将其对应基因AtDOX2编码区克隆到酵母表达载体pPIC9k中,获得重组表达载体pPIC9k-AtDOX2,将线性化的重组载体电击转化入毕赤酵母(Pichia pastoris)表达菌株GS115,经G418筛选、PCR鉴定和甲醇诱导时间优化,获得重组AtDOX2的高效表达菌株GS115/pPIC9k-AtDOX2.SDS-PAGE分析结果显示,0.5%甲醇诱导96 h重组蛋白表达量最高,其表达量占胞外总蛋白的15%.重组AtDOX2的表观分子量约为70kD,经Ni-NTA柱亲和层析可获得纯度大于80%的重组蛋白.2,2-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)法测定结果表明重组蛋白具有过氧化物酶活性,且其活性受Ca2+和Mg2+激活,受EDTA、咪唑和MR2+抑制;2,4-二硝基苯肼(2,4-DNP)法测定结果显示,重组AtDOX2具有双加氧酶活性,Ca2+对其双加氧酶活性也有激活作用.结果说明利用酵母表达系统获得了具有活性的重组AtDOX2,AtDOX2同时具有过氧化物酶活性和双加氧酶活性.
위료획득구유생물활성적의남개(Arabidopsis thaliana)alpha-dioxygenase 2(AtOOX2),장기대응기인AtDOX2편마구극륭도효모표체재체pPIC9k중,획득중조표체재체pPIC9k-AtDOX2,장선성화적중조재체전격전화입필적효모(Pichia pastoris)표체균주GS115,경G418사선、PCR감정화갑순유도시간우화,획득중조AtDOX2적고효표체균주GS115/pPIC9k-AtDOX2.SDS-PAGE분석결과현시,0.5%갑순유도96 h중조단백표체량최고,기표체량점포외총단백적15%.중조AtDOX2적표관분자량약위70kD,경Ni-NTA주친화층석가획득순도대우80%적중조단백.2,2-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)법측정결과표명중조단백구유과양화물매활성,차기활성수Ca2+화Mg2+격활,수EDTA、미서화MR2+억제;2,4-이초기분정(2,4-DNP)법측정결과현시,중조AtDOX2구유쌍가양매활성,Ca2+대기쌍가양매활성야유격활작용.결과설명이용효모표체계통획득료구유활성적중조AtDOX2,AtDOX2동시구유과양화물매활성화쌍가양매활성.