实用医学杂志
實用醫學雜誌
실용의학잡지
THE JOURNAL OF PRACTICAL MEDICINE
2007年
22期
3492-3495
,共4页
毕赤酵母%基因表达%人胰腺α-淀粉酶
畢赤酵母%基因錶達%人胰腺α-澱粉酶
필적효모%기인표체%인이선α-정분매
目的:构建人胰腺α-淀粉酶(HPA)真核表达载体并在毕赤酵母中进行表达.方法:从人胰腺组织中提取总RNA,逆转录为cDNA,RT-PCR法扩增HPA基因,将其插入到酵母分泌性表达质粒pPIC9中,筛选得到正确序列的重组质粒pPIC9-HPA,用该质粒转化毕赤酵母菌GS115,PCR方法筛选阳性克隆,摇瓶培养、0.5%甲醇诱导重组HPA分泌性表达,测定培养上清中的淀粉酶活力;重组HPA用冷乙醇-糖原亲和沉淀、疏水层析纯化并以SDS-PAGE电泳和Western blot方法鉴定.结果:成功构建了重组HPA真核酵母表达载体,重组质粒酶切和核酸测序结果与预期-致,显示HPA基因正确插入质粒pPIC9中;以pPIC9-HPA转化毕赤酵母菌GS115,实现了重组HPA在毕赤酵母菌分泌性表达;重组HPA经纯化后鉴定具天然HPA相同的免疫原性,其对可溶性淀粉酶的水解产物和酶动力学分析与天然HPA相近.结论:成功实现了HPA在毕赤酵母真核表达系统中的分泌性表达,重组HPA与天然HPA具有相似的催化和酶动力学性质.本实验为下一步作为临床HPA测定标准品的研制准备了实验基础.
目的:構建人胰腺α-澱粉酶(HPA)真覈錶達載體併在畢赤酵母中進行錶達.方法:從人胰腺組織中提取總RNA,逆轉錄為cDNA,RT-PCR法擴增HPA基因,將其插入到酵母分泌性錶達質粒pPIC9中,篩選得到正確序列的重組質粒pPIC9-HPA,用該質粒轉化畢赤酵母菌GS115,PCR方法篩選暘性剋隆,搖瓶培養、0.5%甲醇誘導重組HPA分泌性錶達,測定培養上清中的澱粉酶活力;重組HPA用冷乙醇-糖原親和沉澱、疏水層析純化併以SDS-PAGE電泳和Western blot方法鑒定.結果:成功構建瞭重組HPA真覈酵母錶達載體,重組質粒酶切和覈痠測序結果與預期-緻,顯示HPA基因正確插入質粒pPIC9中;以pPIC9-HPA轉化畢赤酵母菌GS115,實現瞭重組HPA在畢赤酵母菌分泌性錶達;重組HPA經純化後鑒定具天然HPA相同的免疫原性,其對可溶性澱粉酶的水解產物和酶動力學分析與天然HPA相近.結論:成功實現瞭HPA在畢赤酵母真覈錶達繫統中的分泌性錶達,重組HPA與天然HPA具有相似的催化和酶動力學性質.本實驗為下一步作為臨床HPA測定標準品的研製準備瞭實驗基礎.
목적:구건인이선α-정분매(HPA)진핵표체재체병재필적효모중진행표체.방법:종인이선조직중제취총RNA,역전록위cDNA,RT-PCR법확증HPA기인,장기삽입도효모분비성표체질립pPIC9중,사선득도정학서렬적중조질립pPIC9-HPA,용해질립전화필적효모균GS115,PCR방법사선양성극륭,요병배양、0.5%갑순유도중조HPA분비성표체,측정배양상청중적정분매활력;중조HPA용랭을순-당원친화침정、소수층석순화병이SDS-PAGE전영화Western blot방법감정.결과:성공구건료중조HPA진핵효모표체재체,중조질립매절화핵산측서결과여예기-치,현시HPA기인정학삽입질립pPIC9중;이pPIC9-HPA전화필적효모균GS115,실현료중조HPA재필적효모균분비성표체;중조HPA경순화후감정구천연HPA상동적면역원성,기대가용성정분매적수해산물화매동역학분석여천연HPA상근.결론:성공실현료HPA재필적효모진핵표체계통중적분비성표체,중조HPA여천연HPA구유상사적최화화매동역학성질.본실험위하일보작위림상HPA측정표준품적연제준비료실험기출.
