生物技术通报
生物技術通報
생물기술통보
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2010年
11期
146-152
,共7页
韦德芳%高健%曾春华%彭明利%任红
韋德芳%高健%曾春華%彭明利%任紅
위덕방%고건%증춘화%팽명리%임홍
pSOS%乙肝病毒%X基因%RNA干扰
pSOS%乙肝病毒%X基因%RNA榦擾
pSOS%을간병독%X기인%RNA간우
构建靶向乙肝病毒(HBV)X基因的真核表达载体pSOS-X-siRNA和pSOS-siRNA,转染肝癌细胞系HepG2和 HepG2.2.15,筛选和验证高效siRNA.设计4个靶向X基因siRNA,将siRNA和HBx基因插入载体pSOS得重组质粒pSOS-X-siRNA;pSOS-X-siRNA经Pac I酶切去除目的片段HBx后得pSOS-siRNA.将质粒pSOS-X-siRNA和pSOS-siRNA分别转HepG2和HepG2.2.15肝癌细胞株.荧光显微镜下观察HepG2细胞绿色荧光(GFP)减弱程度预估干扰效率.ELISA 检测HepG2.2.15细胞上清HBsAg、HBeAg表达,Western blotting检测胞内蛋白HBsAg、HBcAg表达,Real time PCR检测胞内HBs mRNA、HBx mRNA的转录.转染4 d后,siRNA4使HepG2细胞的GFP信号表达程度最低,为阴性对照的9%,预测其干扰效果最强.siRNA4使HepG2.2.15细胞转染后4 d上清的HBsAg蛋白表达为对照的(13.92±1.14)%(P<0.05)、HBeAg为(21.69±4.92)%(P<0.05),胞内的HBsAg、HBcAg蛋白表达量灰度比值为0.175±0.025 、0.0825±0.028,均为各处理组中最低(P<0.01),HBs mRNA和HBx mRNA分别降为对照的0.237±0.028(P<0.01)、0.110±0.022(P<0.01),差异有统计学意义,证实 siRNA4为高效干扰位点.利用pSOS成功筛选并验证构建靶向HBV X基因的siRNA 靶点.
構建靶嚮乙肝病毒(HBV)X基因的真覈錶達載體pSOS-X-siRNA和pSOS-siRNA,轉染肝癌細胞繫HepG2和 HepG2.2.15,篩選和驗證高效siRNA.設計4箇靶嚮X基因siRNA,將siRNA和HBx基因插入載體pSOS得重組質粒pSOS-X-siRNA;pSOS-X-siRNA經Pac I酶切去除目的片段HBx後得pSOS-siRNA.將質粒pSOS-X-siRNA和pSOS-siRNA分彆轉HepG2和HepG2.2.15肝癌細胞株.熒光顯微鏡下觀察HepG2細胞綠色熒光(GFP)減弱程度預估榦擾效率.ELISA 檢測HepG2.2.15細胞上清HBsAg、HBeAg錶達,Western blotting檢測胞內蛋白HBsAg、HBcAg錶達,Real time PCR檢測胞內HBs mRNA、HBx mRNA的轉錄.轉染4 d後,siRNA4使HepG2細胞的GFP信號錶達程度最低,為陰性對照的9%,預測其榦擾效果最彊.siRNA4使HepG2.2.15細胞轉染後4 d上清的HBsAg蛋白錶達為對照的(13.92±1.14)%(P<0.05)、HBeAg為(21.69±4.92)%(P<0.05),胞內的HBsAg、HBcAg蛋白錶達量灰度比值為0.175±0.025 、0.0825±0.028,均為各處理組中最低(P<0.01),HBs mRNA和HBx mRNA分彆降為對照的0.237±0.028(P<0.01)、0.110±0.022(P<0.01),差異有統計學意義,證實 siRNA4為高效榦擾位點.利用pSOS成功篩選併驗證構建靶嚮HBV X基因的siRNA 靶點.
구건파향을간병독(HBV)X기인적진핵표체재체pSOS-X-siRNA화pSOS-siRNA,전염간암세포계HepG2화 HepG2.2.15,사선화험증고효siRNA.설계4개파향X기인siRNA,장siRNA화HBx기인삽입재체pSOS득중조질립pSOS-X-siRNA;pSOS-X-siRNA경Pac I매절거제목적편단HBx후득pSOS-siRNA.장질립pSOS-X-siRNA화pSOS-siRNA분별전HepG2화HepG2.2.15간암세포주.형광현미경하관찰HepG2세포록색형광(GFP)감약정도예고간우효솔.ELISA 검측HepG2.2.15세포상청HBsAg、HBeAg표체,Western blotting검측포내단백HBsAg、HBcAg표체,Real time PCR검측포내HBs mRNA、HBx mRNA적전록.전염4 d후,siRNA4사HepG2세포적GFP신호표체정도최저,위음성대조적9%,예측기간우효과최강.siRNA4사HepG2.2.15세포전염후4 d상청적HBsAg단백표체위대조적(13.92±1.14)%(P<0.05)、HBeAg위(21.69±4.92)%(P<0.05),포내적HBsAg、HBcAg단백표체량회도비치위0.175±0.025 、0.0825±0.028,균위각처리조중최저(P<0.01),HBs mRNA화HBx mRNA분별강위대조적0.237±0.028(P<0.01)、0.110±0.022(P<0.01),차이유통계학의의,증실 siRNA4위고효간우위점.이용pSOS성공사선병험증구건파향HBV X기인적siRNA 파점.
