中国医学科学院学报
中國醫學科學院學報
중국의학과학원학보
ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SINICAE
2011年
6期
632-637
,共6页
程筱雯%梁俊波%缪时英%王琳芳
程篠雯%樑俊波%繆時英%王琳芳
정소문%량준파%무시영%왕림방
蛋白激酶Nemo样激酶%重组腺病毒载体%同源重组
蛋白激酶Nemo樣激酶%重組腺病毒載體%同源重組
단백격매Nemo양격매%중조선병독재체%동원중조
目的 构建含有蛋白激酶Nemo样激酶(NLK)的重组腺病毒载体.方法 采用RT-PCR方法在人胚肾细胞系HEK293T细胞中扩增NLK基因及其突变体K155M、T286V和C425Y,同时在目的基因的C端添加便于蛋白表达检测的FLAG tag,经与载体pAdTrack-CMV连接、转化、筛选、鉴定后,将Western blot检测表达正确的重组过渡质粒pAdTrack-CMV-NLK及其突变体再经酶切、电转入BJ5183感受态细胞(已包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1)同源重组,并筛选、鉴定、扩增.通过Pacl酶切后,以快速简便的乙醇沉淀法替代传统的酚-氯仿-异戊醇法回收酶切产物,用高效低毒高稳定性的FuGENE HD转染试剂替代传统的lipofectamin 2000转染低代数的HEK293A包装细胞,进行病毒包装.包装后的重组腺病毒感染结直肠癌细胞HCT 116,Western blot检测以确认NLK及其突变体蛋白的表达.结果 经PCR、测序及Western blot检测证实,成功构建了携带NLK基因及其突变体的腺病毒载体,PCR及限制性内切酶酶切鉴定重组过渡质粒pAdTrack-CMV-NLK及其突变体与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组成功,重组表达克隆转染HEK293A细胞获得病毒原液,扩增后感染结直肠癌细胞HCT 116能正确表达NLK蛋白及其突变体蛋白.结论 成功制备NLK基因及其突变体重组腺病毒,可进一步用于NLK生理功能的研究.
目的 構建含有蛋白激酶Nemo樣激酶(NLK)的重組腺病毒載體.方法 採用RT-PCR方法在人胚腎細胞繫HEK293T細胞中擴增NLK基因及其突變體K155M、T286V和C425Y,同時在目的基因的C耑添加便于蛋白錶達檢測的FLAG tag,經與載體pAdTrack-CMV連接、轉化、篩選、鑒定後,將Western blot檢測錶達正確的重組過渡質粒pAdTrack-CMV-NLK及其突變體再經酶切、電轉入BJ5183感受態細胞(已包含腺病毒骨架質粒pAdEasy-1)同源重組,併篩選、鑒定、擴增.通過Pacl酶切後,以快速簡便的乙醇沉澱法替代傳統的酚-氯倣-異戊醇法迴收酶切產物,用高效低毒高穩定性的FuGENE HD轉染試劑替代傳統的lipofectamin 2000轉染低代數的HEK293A包裝細胞,進行病毒包裝.包裝後的重組腺病毒感染結直腸癌細胞HCT 116,Western blot檢測以確認NLK及其突變體蛋白的錶達.結果 經PCR、測序及Western blot檢測證實,成功構建瞭攜帶NLK基因及其突變體的腺病毒載體,PCR及限製性內切酶酶切鑒定重組過渡質粒pAdTrack-CMV-NLK及其突變體與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1同源重組成功,重組錶達剋隆轉染HEK293A細胞穫得病毒原液,擴增後感染結直腸癌細胞HCT 116能正確錶達NLK蛋白及其突變體蛋白.結論 成功製備NLK基因及其突變體重組腺病毒,可進一步用于NLK生理功能的研究.
목적 구건함유단백격매Nemo양격매(NLK)적중조선병독재체.방법 채용RT-PCR방법재인배신세포계HEK293T세포중확증NLK기인급기돌변체K155M、T286V화C425Y,동시재목적기인적C단첨가편우단백표체검측적FLAG tag,경여재체pAdTrack-CMV련접、전화、사선、감정후,장Western blot검측표체정학적중조과도질립pAdTrack-CMV-NLK급기돌변체재경매절、전전입BJ5183감수태세포(이포함선병독골가질립pAdEasy-1)동원중조,병사선、감정、확증.통과Pacl매절후,이쾌속간편적을순침정법체대전통적분-록방-이무순법회수매절산물,용고효저독고은정성적FuGENE HD전염시제체대전통적lipofectamin 2000전염저대수적HEK293A포장세포,진행병독포장.포장후적중조선병독감염결직장암세포HCT 116,Western blot검측이학인NLK급기돌변체단백적표체.결과 경PCR、측서급Western blot검측증실,성공구건료휴대NLK기인급기돌변체적선병독재체,PCR급한제성내절매매절감정중조과도질립pAdTrack-CMV-NLK급기돌변체여선병독골가질립pAdEasy-1동원중조성공,중조표체극륭전염HEK293A세포획득병독원액,확증후감염결직장암세포HCT 116능정학표체NLK단백급기돌변체단백.결론 성공제비NLK기인급기돌변체중조선병독,가진일보용우NLK생리공능적연구.
