目的:探讨联合应用血管内皮细胞生长因子(VEGF165) 及血管生成素(ANG-1),对猪慢性缺血心肌中血管生成效应及心功能改善的影响.方法:完全腔镜下放置血管缩窄环于小型猪左冠状动脉回旋支(LCX),建立慢性心肌缺血模型.6周后行心电图、冠状动脉造影和心脏超声检查,确认LCX闭塞或相应心肌的缺血.16只动物随机均分为:单纯注射转染VEGF165组(组Ⅰ,n=4) 、单纯注射转染ANG-1组(组Ⅱ,n=4)、联合注射转染VEGF165与ANG-1组(组Ⅲ,n=4)和注射磷酸盐缓冲液PBS对照组(组Ⅳ,n=4).各组在胸腔镜下,心肌内直接注射rAAV2 ANG-1、rAAV2 VEGF165,剂量为5×1011 vg(virus/genome).治疗后,不同时间点ELISA检测VEGF165和ANG-1蛋白的分泌,冠状动脉造影观察侧枝循环形成的情况,行心脏超声检查观察左心室功能变化.3个月后取注射部位心肌,用Western blot检测VEGF165和ANG-1蛋白的表达情况,免疫组织化学观察心肌毛细血管密度与微小动脉生成情况.结果:放置血管缩窄环后6周,所有动物均出现LCX完全/次全闭塞,或LCX支配区域的心肌缺血.Ⅰ、Ⅲ两组猪体内的VEGF165蛋白分泌水平从基因转染后第7天开始上升,并于第14天达到高峰,随后逐渐下降,尤以Ⅰ组分泌水平为高;其它两组各时间点及组间的VEGF165蛋白分泌水平差异无统计学意义(P>0.05).同样,Ⅱ、Ⅲ两组猪体内的ANG-1蛋白分泌水平的变化与VEGF165蛋白分泌水平类似,尤以Ⅱ组分泌水平为高(P<0.01);其它两组各时间点及组间的ANG-1蛋白分泌水平差异无统计学意义;组Ⅲ中VEGF165与ANG-1蛋白水平变化同步.Western blot检测显示,基因治疗后3个月,组Ⅲ VEGF165、ANG-1蛋白水平都显著高于组Ⅳ(P<0.01),组Ⅲ与组Ⅰ间VEGF165蛋白表达无显著差异(P ＞0.05),组Ⅲ与组Ⅱ间ANG-1蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05).基因治疗3个月后,组Ⅲ左心室室腔缩小,心肌收缩力增强,LCX及其分支较基因转染前增粗、迂回,左回旋支发出侧支,左回旋支远端重新有造影剂充填.组Ⅰ、Ⅱ则有不同程度心肌收缩力增强,充盈改善,但均较组Ⅲ改善幅度小,回旋支见少许造影剂充填,但较组Ⅲ明显少,组Ⅳ处理前后无明显改变.超声检查显示,模型建立术后6周,左心室下壁及后壁变薄,局部运动减弱、不协调,收缩异常;基因转染后1个月、3个月,组Ⅰ、组Ⅱ、组Ⅲ心功能都较转染前有明显改善,组Ⅳ无明显变化;组Ⅲ 的EF与FS改善程度要明显好于其他各组.CD34免疫组化染色评价血管密度,组Ⅲ缺血区血管计数高于组Ⅰ、组Ⅱ,差异有统计学意义(P<0.05),对照组Ⅳ的心肌内毛细血管数目很少.应用α-SMA免疫组化染色评价小动脉形成,结果提示,基因转染3个月后组Ⅳ心肌中小动脉密度最低,其余各组心肌中均有较多的小动脉新生,尤以组Ⅲ最为显著.结论:完全腔镜下放置血管缩窄环及完成心肌内注射切实可行,在胸腔镜下建立的小型猪慢性心肌缺血模型中,心肌内注射rAAV2 VEGF165 、rAAV2 ANG-1可以有效地转染小型猪心肌组织,外源基因长期稳定表达,同时ANG-1能协同VEGF165作用,从而显著地提高其促进缺血心肌毛细血管和小动脉生成,促进有效侧枝循环形成并改善心功能.
目的:探討聯閤應用血管內皮細胞生長因子(VEGF165) 及血管生成素(ANG-1),對豬慢性缺血心肌中血管生成效應及心功能改善的影響.方法:完全腔鏡下放置血管縮窄環于小型豬左冠狀動脈迴鏇支(LCX),建立慢性心肌缺血模型.6週後行心電圖、冠狀動脈造影和心髒超聲檢查,確認LCX閉塞或相應心肌的缺血.16隻動物隨機均分為:單純註射轉染VEGF165組(組Ⅰ,n=4) 、單純註射轉染ANG-1組(組Ⅱ,n=4)、聯閤註射轉染VEGF165與ANG-1組(組Ⅲ,n=4)和註射燐痠鹽緩遲液PBS對照組(組Ⅳ,n=4).各組在胸腔鏡下,心肌內直接註射rAAV2 ANG-1、rAAV2 VEGF165,劑量為5×1011 vg(virus/genome).治療後,不同時間點ELISA檢測VEGF165和ANG-1蛋白的分泌,冠狀動脈造影觀察側枝循環形成的情況,行心髒超聲檢查觀察左心室功能變化.3箇月後取註射部位心肌,用Western blot檢測VEGF165和ANG-1蛋白的錶達情況,免疫組織化學觀察心肌毛細血管密度與微小動脈生成情況.結果:放置血管縮窄環後6週,所有動物均齣現LCX完全/次全閉塞,或LCX支配區域的心肌缺血.Ⅰ、Ⅲ兩組豬體內的VEGF165蛋白分泌水平從基因轉染後第7天開始上升,併于第14天達到高峰,隨後逐漸下降,尤以Ⅰ組分泌水平為高;其它兩組各時間點及組間的VEGF165蛋白分泌水平差異無統計學意義(P>0.05).同樣,Ⅱ、Ⅲ兩組豬體內的ANG-1蛋白分泌水平的變化與VEGF165蛋白分泌水平類似,尤以Ⅱ組分泌水平為高(P<0.01);其它兩組各時間點及組間的ANG-1蛋白分泌水平差異無統計學意義;組Ⅲ中VEGF165與ANG-1蛋白水平變化同步.Western blot檢測顯示,基因治療後3箇月,組Ⅲ VEGF165、ANG-1蛋白水平都顯著高于組Ⅳ(P<0.01),組Ⅲ與組Ⅰ間VEGF165蛋白錶達無顯著差異(P ＞0.05),組Ⅲ與組Ⅱ間ANG-1蛋白錶達差異無統計學意義(P＞0.05).基因治療3箇月後,組Ⅲ左心室室腔縮小,心肌收縮力增彊,LCX及其分支較基因轉染前增粗、迂迴,左迴鏇支髮齣側支,左迴鏇支遠耑重新有造影劑充填.組Ⅰ、Ⅱ則有不同程度心肌收縮力增彊,充盈改善,但均較組Ⅲ改善幅度小,迴鏇支見少許造影劑充填,但較組Ⅲ明顯少,組Ⅳ處理前後無明顯改變.超聲檢查顯示,模型建立術後6週,左心室下壁及後壁變薄,跼部運動減弱、不協調,收縮異常;基因轉染後1箇月、3箇月,組Ⅰ、組Ⅱ、組Ⅲ心功能都較轉染前有明顯改善,組Ⅳ無明顯變化;組Ⅲ 的EF與FS改善程度要明顯好于其他各組.CD34免疫組化染色評價血管密度,組Ⅲ缺血區血管計數高于組Ⅰ、組Ⅱ,差異有統計學意義(P<0.05),對照組Ⅳ的心肌內毛細血管數目很少.應用α-SMA免疫組化染色評價小動脈形成,結果提示,基因轉染3箇月後組Ⅳ心肌中小動脈密度最低,其餘各組心肌中均有較多的小動脈新生,尤以組Ⅲ最為顯著.結論:完全腔鏡下放置血管縮窄環及完成心肌內註射切實可行,在胸腔鏡下建立的小型豬慢性心肌缺血模型中,心肌內註射rAAV2 VEGF165 、rAAV2 ANG-1可以有效地轉染小型豬心肌組織,外源基因長期穩定錶達,同時ANG-1能協同VEGF165作用,從而顯著地提高其促進缺血心肌毛細血管和小動脈生成,促進有效側枝循環形成併改善心功能.
목적:탐토연합응용혈관내피세포생장인자(VEGF165) 급혈관생성소(ANG-1),대저만성결혈심기중혈관생성효응급심공능개선적영향.방법:완전강경하방치혈관축착배우소형저좌관상동맥회선지(LCX),건립만성심기결혈모형.6주후행심전도、관상동맥조영화심장초성검사,학인LCX폐새혹상응심기적결혈.16지동물수궤균분위:단순주사전염VEGF165조(조Ⅰ,n=4) 、단순주사전염ANG-1조(조Ⅱ,n=4)、연합주사전염VEGF165여ANG-1조(조Ⅲ,n=4)화주사린산염완충액PBS대조조(조Ⅳ,n=4).각조재흉강경하,심기내직접주사rAAV2 ANG-1、rAAV2 VEGF165,제량위5×1011 vg(virus/genome).치료후,불동시간점ELISA검측VEGF165화ANG-1단백적분비,관상동맥조영관찰측지순배형성적정황,행심장초성검사관찰좌심실공능변화.3개월후취주사부위심기,용Western blot검측VEGF165화ANG-1단백적표체정황,면역조직화학관찰심기모세혈관밀도여미소동맥생성정황.결과:방치혈관축착배후6주,소유동물균출현LCX완전/차전폐새,혹LCX지배구역적심기결혈.Ⅰ、Ⅲ량조저체내적VEGF165단백분비수평종기인전염후제7천개시상승,병우제14천체도고봉,수후축점하강,우이Ⅰ조분비수평위고;기타량조각시간점급조간적VEGF165단백분비수평차이무통계학의의(P>0.05).동양,Ⅱ、Ⅲ량조저체내적ANG-1단백분비수평적변화여VEGF165단백분비수평유사,우이Ⅱ조분비수평위고(P<0.01);기타량조각시간점급조간적ANG-1단백분비수평차이무통계학의의;조Ⅲ중VEGF165여ANG-1단백수평변화동보.Western blot검측현시,기인치료후3개월,조Ⅲ VEGF165、ANG-1단백수평도현저고우조Ⅳ(P<0.01),조Ⅲ여조Ⅰ간VEGF165단백표체무현저차이(P ＞0.05),조Ⅲ여조Ⅱ간ANG-1단백표체차이무통계학의의(P＞0.05).기인치료3개월후,조Ⅲ좌심실실강축소,심기수축력증강,LCX급기분지교기인전염전증조、우회,좌회선지발출측지,좌회선지원단중신유조영제충전.조Ⅰ、Ⅱ칙유불동정도심기수축력증강,충영개선,단균교조Ⅲ개선폭도소,회선지견소허조영제충전,단교조Ⅲ명현소,조Ⅳ처리전후무명현개변.초성검사현시,모형건립술후6주,좌심실하벽급후벽변박,국부운동감약、불협조,수축이상;기인전염후1개월、3개월,조Ⅰ、조Ⅱ、조Ⅲ심공능도교전염전유명현개선,조Ⅳ무명현변화;조Ⅲ 적EF여FS개선정도요명현호우기타각조.CD34면역조화염색평개혈관밀도,조Ⅲ결혈구혈관계수고우조Ⅰ、조Ⅱ,차이유통계학의의(P<0.05),대조조Ⅳ적심기내모세혈관수목흔소.응용α-SMA면역조화염색평개소동맥형성,결과제시,기인전염3개월후조Ⅳ심기중소동맥밀도최저,기여각조심기중균유교다적소동맥신생,우이조Ⅲ최위현저.결론:완전강경하방치혈관축착배급완성심기내주사절실가행,재흉강경하건립적소형저만성심기결혈모형중,심기내주사rAAV2 VEGF165 、rAAV2 ANG-1가이유효지전염소형저심기조직,외원기인장기은정표체,동시ANG-1능협동VEGF165작용,종이현저지제고기촉진결혈심기모세혈관화소동맥생성,촉진유효측지순배형성병개선심공능.
