细胞与分子免疫学杂志
細胞與分子免疫學雜誌
세포여분자면역학잡지
2009年
2期
107-110
,共4页
李雅贞%王胜军%石燕%戴晓莉%彭素芳%苏兆亮%邵启祥%许化溪
李雅貞%王勝軍%石燕%戴曉莉%彭素芳%囌兆亮%邵啟祥%許化溪
리아정%왕성군%석연%대효리%팽소방%소조량%소계상%허화계
Runx3基因%cDNA克隆%RT-PCR%原核表达
Runx3基因%cDNA剋隆%RT-PCR%原覈錶達
Runx3기인%cDNA극륭%RT-PCR%원핵표체
目的:克隆人Runx3基因全长编码区的cDNA,进行鉴定和测序分析,并利用载体pQE30在大肠埃希菌(M15)原核表达人Runx3基因全长序列,为从转录水平探讨Runx3基因与免疫相关性疾病以及肿瘤发生发展的关系奠定基础.方法:MACS分离外周CD8+T细胞;采用RT-PCR方法从人外周血CD8+T细胞获得Runx3基因的cDNA,并连接pMD19-T载体导入大肠埃希菌DH5α,选择阳性克隆,应用M13 F/R通用引物进行双向反应测序,以作序列鉴定.利用PCR技术从克隆载体pMD19-T/Runx3获得人Runx3的全长编码序列,亚克隆至原核表达载体pQE30,形成重组表达质粒pQE30/Runx3;酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌M15,测序鉴定后经IPTG 30%诱导4 h,SDS-PAGE电泳判断以包涵体形式存在的带有His标签的融合蛋白并进行Western blot鉴定.结果:扩增获得的Runx3基因CDS区全长1 248 bp,编码415个氨基酸残基,与GenBank中发表的序列完全一致.成功构建了原核表达载体pQE30/Runx3,并在工程菌M15中获得大量表达.结论:获得了人Runx3基因的克隆,并成功原核表达和制备出人Runx3融合蛋白.
目的:剋隆人Runx3基因全長編碼區的cDNA,進行鑒定和測序分析,併利用載體pQE30在大腸埃希菌(M15)原覈錶達人Runx3基因全長序列,為從轉錄水平探討Runx3基因與免疫相關性疾病以及腫瘤髮生髮展的關繫奠定基礎.方法:MACS分離外週CD8+T細胞;採用RT-PCR方法從人外週血CD8+T細胞穫得Runx3基因的cDNA,併連接pMD19-T載體導入大腸埃希菌DH5α,選擇暘性剋隆,應用M13 F/R通用引物進行雙嚮反應測序,以作序列鑒定.利用PCR技術從剋隆載體pMD19-T/Runx3穫得人Runx3的全長編碼序列,亞剋隆至原覈錶達載體pQE30,形成重組錶達質粒pQE30/Runx3;酶切鑒定挑選暘性重組質粒轉化大腸埃希菌M15,測序鑒定後經IPTG 30%誘導4 h,SDS-PAGE電泳判斷以包涵體形式存在的帶有His標籤的融閤蛋白併進行Western blot鑒定.結果:擴增穫得的Runx3基因CDS區全長1 248 bp,編碼415箇氨基痠殘基,與GenBank中髮錶的序列完全一緻.成功構建瞭原覈錶達載體pQE30/Runx3,併在工程菌M15中穫得大量錶達.結論:穫得瞭人Runx3基因的剋隆,併成功原覈錶達和製備齣人Runx3融閤蛋白.
목적:극륭인Runx3기인전장편마구적cDNA,진행감정화측서분석,병이용재체pQE30재대장애희균(M15)원핵표체인Runx3기인전장서렬,위종전록수평탐토Runx3기인여면역상관성질병이급종류발생발전적관계전정기출.방법:MACS분리외주CD8+T세포;채용RT-PCR방법종인외주혈CD8+T세포획득Runx3기인적cDNA,병련접pMD19-T재체도입대장애희균DH5α,선택양성극륭,응용M13 F/R통용인물진행쌍향반응측서,이작서렬감정.이용PCR기술종극륭재체pMD19-T/Runx3획득인Runx3적전장편마서렬,아극륭지원핵표체재체pQE30,형성중조표체질립pQE30/Runx3;매절감정도선양성중조질립전화대장애희균M15,측서감정후경IPTG 30%유도4 h,SDS-PAGE전영판단이포함체형식존재적대유His표첨적융합단백병진행Western blot감정.결과:확증획득적Runx3기인CDS구전장1 248 bp,편마415개안기산잔기,여GenBank중발표적서렬완전일치.성공구건료원핵표체재체pQE30/Runx3,병재공정균M15중획득대량표체.결론:획득료인Runx3기인적극륭,병성공원핵표체화제비출인Runx3융합단백.
