中华烧伤杂志
中華燒傷雜誌
중화소상잡지
16
2006年
4期
291-295
,共5页
孙亚丽%刘友生%杨海捷%王长松%马建洲
孫亞麗%劉友生%楊海捷%王長鬆%馬建洲
손아려%류우생%양해첩%왕장송%마건주
基因表达%内毒素类%内毒素结合肽%突变体%纯化
基因錶達%內毒素類%內毒素結閤肽%突變體%純化
기인표체%내독소류%내독소결합태%돌변체%순화
目的 使内毒素结合肽(EBP)及其突变体mEBP在E.coli DH5α中表达,纯化后鉴定其抗内毒素/脂多糖(LPS)活性.方法 (1)将含PinpointXa3-EBP及其突变体PinpointXa3-mEBP的工程菌DH5α活化,加入异丙硫半乳糖苷(IPTG)诱导其表达生物素融合蛋白.分离纯化表达产物,因子Xa酶切融合蛋白分离目的肽EBP和mEBP.采用亲和层析及反相高效液相色谱法纯化目的肽,用氨基末端10个氨基酸残基序列分析法鉴定突变体mEBP.(2)分离正常人外周血单核细胞(PBMC),用5 mg/L异硫氰酸荧光素(FITC)-LPS+不同浓度EBP或mEBP(均为2.0、5.0、12.5 mg/L)刺激PBMC,检测其平均荧光强度.用1 mg/L LPS+3种浓度(同前)EBP或mEBP刺激PBMC,5 h后取上清液,检测肿瘤坏死因子(TNF)α和白细胞介素(IL)6浓度.(3)将25只昆明小鼠分为正常对照组(5只):腹腔注射等渗盐水0.2 ml;模型组(5只):小鼠造成20%TBSAⅢ度烧伤,伤后腹腔注射LPS(1 mg/kg);治疗组(15只):小鼠同前致伤后,腹腔注射多黏菌素B(PMB,5 mg/kg)或EBP或mEBP(后两者均为10 mg/kg).6 h后检测各组小鼠血清TNF-α、IL-6浓度及肝组织中TNF-α mRNA的表达水平.结果 (1)纯化后的目的肽EBP、mEBP纯度均达98%以上,mEBP氨基末端10个氨基酸残基序列分析符合预期结果.(2)随着mEBP或EBP浓度的增加,PBMC表面的平均荧光强度逐渐减弱;且在同一浓度下,加入mEBP后平均荧光强度的减弱程度较加入EBP明显.与用1 mg/LLPS刺激PBMC比较,加入1 mg/L LPS+12.5 mg/L EBP以及1 mg/L LPS+3种浓度mEBP刺激后,PBMC培养上清液中IL-6及TNF-α的水平均明显降低(P＜0.01).(3)与模型组比较,治疗组小鼠血清IL-6、TNF-α水平均明显降低(P＜0.01),其中10 mg/kg mEBP治疗组两指标低于等浓度EBP治疗组(P＜0.05).(4)小鼠肝组织TNF-α mRNA表达水平:正常对照组相对灰度值为0.25,模型组为0.93,10 mg/kg mEBP治疗组为0.51,10 mg/kg EBP治疗组为0.77,5 mg/kg PMB治疗组为0.43.结论 具有抗LPS活性的小分子肽可通过原核表达获得;EBP及mEBP均具有抗LPS活性,其中mEBP拮抗作用更强.
目的 使內毒素結閤肽(EBP)及其突變體mEBP在E.coli DH5α中錶達,純化後鑒定其抗內毒素/脂多糖(LPS)活性.方法 (1)將含PinpointXa3-EBP及其突變體PinpointXa3-mEBP的工程菌DH5α活化,加入異丙硫半乳糖苷(IPTG)誘導其錶達生物素融閤蛋白.分離純化錶達產物,因子Xa酶切融閤蛋白分離目的肽EBP和mEBP.採用親和層析及反相高效液相色譜法純化目的肽,用氨基末耑10箇氨基痠殘基序列分析法鑒定突變體mEBP.(2)分離正常人外週血單覈細胞(PBMC),用5 mg/L異硫氰痠熒光素(FITC)-LPS+不同濃度EBP或mEBP(均為2.0、5.0、12.5 mg/L)刺激PBMC,檢測其平均熒光彊度.用1 mg/L LPS+3種濃度(同前)EBP或mEBP刺激PBMC,5 h後取上清液,檢測腫瘤壞死因子(TNF)α和白細胞介素(IL)6濃度.(3)將25隻昆明小鼠分為正常對照組(5隻):腹腔註射等滲鹽水0.2 ml;模型組(5隻):小鼠造成20%TBSAⅢ度燒傷,傷後腹腔註射LPS(1 mg/kg);治療組(15隻):小鼠同前緻傷後,腹腔註射多黏菌素B(PMB,5 mg/kg)或EBP或mEBP(後兩者均為10 mg/kg).6 h後檢測各組小鼠血清TNF-α、IL-6濃度及肝組織中TNF-α mRNA的錶達水平.結果 (1)純化後的目的肽EBP、mEBP純度均達98%以上,mEBP氨基末耑10箇氨基痠殘基序列分析符閤預期結果.(2)隨著mEBP或EBP濃度的增加,PBMC錶麵的平均熒光彊度逐漸減弱;且在同一濃度下,加入mEBP後平均熒光彊度的減弱程度較加入EBP明顯.與用1 mg/LLPS刺激PBMC比較,加入1 mg/L LPS+12.5 mg/L EBP以及1 mg/L LPS+3種濃度mEBP刺激後,PBMC培養上清液中IL-6及TNF-α的水平均明顯降低(P＜0.01).(3)與模型組比較,治療組小鼠血清IL-6、TNF-α水平均明顯降低(P＜0.01),其中10 mg/kg mEBP治療組兩指標低于等濃度EBP治療組(P＜0.05).(4)小鼠肝組織TNF-α mRNA錶達水平:正常對照組相對灰度值為0.25,模型組為0.93,10 mg/kg mEBP治療組為0.51,10 mg/kg EBP治療組為0.77,5 mg/kg PMB治療組為0.43.結論 具有抗LPS活性的小分子肽可通過原覈錶達穫得;EBP及mEBP均具有抗LPS活性,其中mEBP拮抗作用更彊.
목적 사내독소결합태(EBP)급기돌변체mEBP재E.coli DH5α중표체,순화후감정기항내독소/지다당(LPS)활성.방법 (1)장함PinpointXa3-EBP급기돌변체PinpointXa3-mEBP적공정균DH5α활화,가입이병류반유당감(IPTG)유도기표체생물소융합단백.분리순화표체산물,인자Xa매절융합단백분리목적태EBP화mEBP.채용친화층석급반상고효액상색보법순화목적태,용안기말단10개안기산잔기서렬분석법감정돌변체mEBP.(2)분리정상인외주혈단핵세포(PBMC),용5 mg/L이류청산형광소(FITC)-LPS+불동농도EBP혹mEBP(균위2.0、5.0、12.5 mg/L)자격PBMC,검측기평균형광강도.용1 mg/L LPS+3충농도(동전)EBP혹mEBP자격PBMC,5 h후취상청액,검측종류배사인자(TNF)α화백세포개소(IL)6농도.(3)장25지곤명소서분위정상대조조(5지):복강주사등삼염수0.2 ml;모형조(5지):소서조성20%TBSAⅢ도소상,상후복강주사LPS(1 mg/kg);치료조(15지):소서동전치상후,복강주사다점균소B(PMB,5 mg/kg)혹EBP혹mEBP(후량자균위10 mg/kg).6 h후검측각조소서혈청TNF-α、IL-6농도급간조직중TNF-α mRNA적표체수평.결과 (1)순화후적목적태EBP、mEBP순도균체98%이상,mEBP안기말단10개안기산잔기서렬분석부합예기결과.(2)수착mEBP혹EBP농도적증가,PBMC표면적평균형광강도축점감약;차재동일농도하,가입mEBP후평균형광강도적감약정도교가입EBP명현.여용1 mg/LLPS자격PBMC비교,가입1 mg/L LPS+12.5 mg/L EBP이급1 mg/L LPS+3충농도mEBP자격후,PBMC배양상청액중IL-6급TNF-α적수평균명현강저(P＜0.01).(3)여모형조비교,치료조소서혈청IL-6、TNF-α수평균명현강저(P＜0.01),기중10 mg/kg mEBP치료조량지표저우등농도EBP치료조(P＜0.05).(4)소서간조직TNF-α mRNA표체수평:정상대조조상대회도치위0.25,모형조위0.93,10 mg/kg mEBP치료조위0.51,10 mg/kg EBP치료조위0.77,5 mg/kg PMB치료조위0.43.결론 구유항LPS활성적소분자태가통과원핵표체획득;EBP급mEBP균구유항LPS활성,기중mEBP길항작용경강.
