畜牧兽医学报
畜牧獸醫學報
축목수의학보
2013年
7期
1008-1013
,共6页
鞠辉明%白立景%姜星%李奎
鞠輝明%白立景%薑星%李奎
국휘명%백립경%강성%리규
诱导表达%猪生长激素%整合型%真核表达载体
誘導錶達%豬生長激素%整閤型%真覈錶達載體
유도표체%저생장격소%정합형%진핵표체재체
inducible expression%porcine growth hormone%integrated%eukaryotic expression vector
旨在构建整合型诱导表达猪生长激素(Porcine growth hormone,pGH)载体,在细胞水平验证其诱导效率及表达效率.从pTRE-GH12载体上扩增TRE-GH片段,通过SalⅠ酶切位点连接到pCAGGS-rtTA载体中,构建重组载体pCAGGS-rtTA-TRE-GH 12(下称pTTGH),将pTTGH质粒转染猪PK15细胞,经G418筛选后,在培养液中添加诱导底物强力霉素(Doxycycline,DOX)后不同时间段通过实时荧光定量PCR (QRT-PCR)测定细胞内pGH mRNA的表达；在培养液中添加不同浓度的的DOX,通过QRT-PCR及Western blot测定细胞内pGH的表达变化.酶切及测序结果表明成功构建了pTTGH载体；QRT-PCR结果表明,和对照组相比,试验组细胞培养液中添加诱导底物后外源GH基因表达在36 h时最高；在一定浓度范围内,外源GH表达水平和添加DOX的浓度呈现出正相关性,而正常细胞组中GH的表达水平不受DOX添加与否及量的影响.通过条带灰度分析Western杂交结果验证了培养基中一定范围内DOX浓度和pGH表达量呈现出正相关.试验结果表明,本研究成功构建了整合型诱导表达GH载体并能实现GH的可控表达,本研究为以后制备可控表达GH转基因动物、进一步研究GH对机体影响奠定基础.
旨在構建整閤型誘導錶達豬生長激素(Porcine growth hormone,pGH)載體,在細胞水平驗證其誘導效率及錶達效率.從pTRE-GH12載體上擴增TRE-GH片段,通過SalⅠ酶切位點連接到pCAGGS-rtTA載體中,構建重組載體pCAGGS-rtTA-TRE-GH 12(下稱pTTGH),將pTTGH質粒轉染豬PK15細胞,經G418篩選後,在培養液中添加誘導底物彊力黴素(Doxycycline,DOX)後不同時間段通過實時熒光定量PCR (QRT-PCR)測定細胞內pGH mRNA的錶達；在培養液中添加不同濃度的的DOX,通過QRT-PCR及Western blot測定細胞內pGH的錶達變化.酶切及測序結果錶明成功構建瞭pTTGH載體；QRT-PCR結果錶明,和對照組相比,試驗組細胞培養液中添加誘導底物後外源GH基因錶達在36 h時最高；在一定濃度範圍內,外源GH錶達水平和添加DOX的濃度呈現齣正相關性,而正常細胞組中GH的錶達水平不受DOX添加與否及量的影響.通過條帶灰度分析Western雜交結果驗證瞭培養基中一定範圍內DOX濃度和pGH錶達量呈現齣正相關.試驗結果錶明,本研究成功構建瞭整閤型誘導錶達GH載體併能實現GH的可控錶達,本研究為以後製備可控錶達GH轉基因動物、進一步研究GH對機體影響奠定基礎.
지재구건정합형유도표체저생장격소(Porcine growth hormone,pGH)재체,재세포수평험증기유도효솔급표체효솔.종pTRE-GH12재체상확증TRE-GH편단,통과SalⅠ매절위점련접도pCAGGS-rtTA재체중,구건중조재체pCAGGS-rtTA-TRE-GH 12(하칭pTTGH),장pTTGH질립전염저PK15세포,경G418사선후,재배양액중첨가유도저물강력매소(Doxycycline,DOX)후불동시간단통과실시형광정량PCR (QRT-PCR)측정세포내pGH mRNA적표체；재배양액중첨가불동농도적적DOX,통과QRT-PCR급Western blot측정세포내pGH적표체변화.매절급측서결과표명성공구건료pTTGH재체；QRT-PCR결과표명,화대조조상비,시험조세포배양액중첨가유도저물후외원GH기인표체재36 h시최고；재일정농도범위내,외원GH표체수평화첨가DOX적농도정현출정상관성,이정상세포조중GH적표체수평불수DOX첨가여부급량적영향.통과조대회도분석Western잡교결과험증료배양기중일정범위내DOX농도화pGH표체량정현출정상관.시험결과표명,본연구성공구건료정합형유도표체GH재체병능실현GH적가공표체,본연구위이후제비가공표체GH전기인동물、진일보연구GH대궤체영향전정기출.
