CAJ | 학술논문

目的构建小鼠甲状旁腺素受体(PTHR)及其突变受体(DSEL)全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达PTHR及DSEL的HEK293细胞系,以应用于甲状旁腺素(PTH)模拟肽活性药物筛选及其信号通路的研究.方法通过双酶切、胶回收方法分别纯化目的片段(PTHR、DSEL基因)和质粒pcDNA3.1(+),二者分别由DNA限制性内切酶EcoR Ⅰ与Not Ⅰ双酶切,经T4DNA Ligase连接的方法将PTHR、DSEL基因克隆到质粒表达载体pcDNA3.1(+)中,采用测序方法及DNA限制性内切酶EcoRⅠ与NotⅠ双酶切方法鉴定重组质粒,脂质体转染法将重组体pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1 (+)-DSEL及空质粒pcDNA3.1(+)分别转染至HEK293细胞,经G418筛选抗性细胞克隆,、RT-PCR及ELISA检测转染细胞PTHR、DSEL的表达情况.结果重组质粒经基因测序及DNA限制性内切酶EcoR Ⅰ与Not Ⅰ双酶切证实质粒表达载体pcDNA3.1 (+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL构建正确.重组体经脂质体法转染HEK293 48h后,经G418筛选3周得到细胞抗性克隆,ELISA检测到PTHR、DSEL基因在重组质粒表达载体pcDNA3.1 (+)-PTHR、pcDNA3.1 (+)-DSEL转染的HEK293中成功表达.RT-PCR方法检测到PTHR、DSEL基因在转录水平的表达.ELISA方法检测到重组质粒转染的HEK293中,加入甲状旁腺激素刺激后,PLC、cAMP蛋白表达量远高于空质粒pcDNA3.1(+)转染的HEK293中PLC、cAMP的表达.结论成功构建了稳定高表达PTHR、DSEL的HEK293细胞,该稳定转染细胞系的建立为进一步研究甲状旁腺素受体下游信号通道的分子机制以及筛选其模拟肽作用的活性奠定了实验基础.
목적 구건소서갑상방선소수체(PTHR)급기돌변수체(DSEL)전장결구기인진핵표체재체,건립은정고표체PTHR급DSEL적HEK293세포계,이응용우갑상방선소(PTH)모의태활성약물사선급기신호통로적연구.방법 통과쌍매절、효회수방법분별순화목적편단(PTHR、DSEL기인)화질립pcDNA3.1(+),이자분별유DNA한제성내절매EcoR Ⅰ여Not Ⅰ쌍매절,경T4DNA Ligase련접적방법장PTHR、DSEL기인극륭도질립표체재체pcDNA3.1(+)중,채용측서방법급DNA한제성내절매EcoRⅠ여NotⅠ쌍매절방법감정중조질립,지질체전염법장중조체pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1 (+)-DSEL급공질립pcDNA3.1(+)분별전염지HEK293세포,경G418사선항성세포극륭,、RT-PCR급ELISA검측전염세포PTHR、DSEL적표체정황.결과 중조질립경기인측서급DNA한제성내절매EcoR Ⅰ여Not Ⅰ쌍매절증실질립표체재체pcDNA3.1 (+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL구건정학.중조체경지질체법전염HEK293 48h후,경G418사선3주득도세포항성극륭,ELISA검측도PTHR、DSEL기인재중조질립표체재체pcDNA3.1 (+)-PTHR、pcDNA3.1 (+)-DSEL전염적HEK293중성공표체.RT-PCR방법검측도PTHR、DSEL기인재전록수평적표체.ELISA방법검측도중조질립전염적HEK293중,가입갑상방선격소자격후,PLC、cAMP단백표체량원고우공질립pcDNA3.1(+)전염적HEK293중PLC、cAMP적표체.결론 성공구건료은정고표체PTHR、DSEL적HEK293세포,해은정전염세포계적건립위진일보연구갑상방선소수체하유신호통도적분자궤제이급사선기모의태작용적활성전정료실험기출.