安徽医科大学学报
安徽醫科大學學報
안휘의과대학학보
ACTA UNIVERSITY MEDICINALIS ANHUI
2013年
4期
341-345
,共5页
p53上调凋亡调制物%pIRES2-EGFP%定点突变%真核表达载体
p53上調凋亡調製物%pIRES2-EGFP%定點突變%真覈錶達載體
p53상조조망조제물%pIRES2-EGFP%정점돌변%진핵표체재체
目的 构建促凋亡基因p53上调凋亡调制物(PU-MA)的真核表达载体和针对其磷酸化位点定点突变的真核表达载体,为进一步研究其功能奠定基础.方法 通过PCR方法从pCEP4-(HA)2-PUMA质粒中扩增PUMA基因,并克隆到plRES2-EGFP载体上,构建PUMA真核表达载体plRES2-EGFP-(HA)2-PUMA,利用定点突变技术构建pIRES2-EGFP-(HA) 2-PUMA-T28G,行PCR及测序鉴定；脂质体分别将两种质粒转染Hela细胞,同时设未转染的阴性对照组及转染空载体组(4个实验组)；PI染色观察PUMA对细胞的促凋亡作用；流式细胞仪检测细胞凋亡率；RT-PCR检测PUMA的表达；Western blot检测突变型PUMA蛋白和标签蛋白的表达.结果 经PCR及测序结果表明,正确构建野生型、突变型PUMA重组质粒,PUMA基因第10位氨基酸的第28 ～ 30位碱基由丝氨酸(TCC)突变为丙氨酸(GCC),其他碱基均无突变；野生型、突变型PUMA重组质粒转染Hela细胞荧光显微镜观察到绿色荧光,而PI染色观察到野生型、突变型PUMA对Hela细胞的促凋亡作用；流式细胞术检测结果显示突变型和野生型PUMA转染组凋亡率高于阴性对照组和空载体转染组；Western blot和RT-PCR检测出目的基因的高表达.结论 成功构建了PUMA基因及其定点突变载体,为深入研究PUMA基因的抑癌功能及其翻译后调节奠定基础.
目的 構建促凋亡基因p53上調凋亡調製物(PU-MA)的真覈錶達載體和針對其燐痠化位點定點突變的真覈錶達載體,為進一步研究其功能奠定基礎.方法 通過PCR方法從pCEP4-(HA)2-PUMA質粒中擴增PUMA基因,併剋隆到plRES2-EGFP載體上,構建PUMA真覈錶達載體plRES2-EGFP-(HA)2-PUMA,利用定點突變技術構建pIRES2-EGFP-(HA) 2-PUMA-T28G,行PCR及測序鑒定；脂質體分彆將兩種質粒轉染Hela細胞,同時設未轉染的陰性對照組及轉染空載體組(4箇實驗組)；PI染色觀察PUMA對細胞的促凋亡作用；流式細胞儀檢測細胞凋亡率；RT-PCR檢測PUMA的錶達；Western blot檢測突變型PUMA蛋白和標籤蛋白的錶達.結果 經PCR及測序結果錶明,正確構建野生型、突變型PUMA重組質粒,PUMA基因第10位氨基痠的第28 ～ 30位堿基由絲氨痠(TCC)突變為丙氨痠(GCC),其他堿基均無突變；野生型、突變型PUMA重組質粒轉染Hela細胞熒光顯微鏡觀察到綠色熒光,而PI染色觀察到野生型、突變型PUMA對Hela細胞的促凋亡作用；流式細胞術檢測結果顯示突變型和野生型PUMA轉染組凋亡率高于陰性對照組和空載體轉染組；Western blot和RT-PCR檢測齣目的基因的高錶達.結論 成功構建瞭PUMA基因及其定點突變載體,為深入研究PUMA基因的抑癌功能及其翻譯後調節奠定基礎.
목적 구건촉조망기인p53상조조망조제물(PU-MA)적진핵표체재체화침대기린산화위점정점돌변적진핵표체재체,위진일보연구기공능전정기출.방법 통과PCR방법종pCEP4-(HA)2-PUMA질립중확증PUMA기인,병극륭도plRES2-EGFP재체상,구건PUMA진핵표체재체plRES2-EGFP-(HA)2-PUMA,이용정점돌변기술구건pIRES2-EGFP-(HA) 2-PUMA-T28G,행PCR급측서감정；지질체분별장량충질립전염Hela세포,동시설미전염적음성대조조급전염공재체조(4개실험조)；PI염색관찰PUMA대세포적촉조망작용；류식세포의검측세포조망솔；RT-PCR검측PUMA적표체；Western blot검측돌변형PUMA단백화표첨단백적표체.결과 경PCR급측서결과표명,정학구건야생형、돌변형PUMA중조질립,PUMA기인제10위안기산적제28 ～ 30위감기유사안산(TCC)돌변위병안산(GCC),기타감기균무돌변；야생형、돌변형PUMA중조질립전염Hela세포형광현미경관찰도록색형광,이PI염색관찰도야생형、돌변형PUMA대Hela세포적촉조망작용；류식세포술검측결과현시돌변형화야생형PUMA전염조조망솔고우음성대조조화공재체전염조；Western blot화RT-PCR검측출목적기인적고표체.결론 성공구건료PUMA기인급기정점돌변재체,위심입연구PUMA기인적억암공능급기번역후조절전정기출.
