解剖学杂志
解剖學雜誌
해부학잡지
CHINESE JOURNAL OF ANATOMY
2013年
4期
747-750,836
,共5页
万林燕%张巧娟%彭虎%夏鑫%柳长柏%吴江锋%张艳琼
萬林燕%張巧娟%彭虎%夏鑫%柳長柏%吳江鋒%張豔瓊
만림연%장교연%팽호%하흠%류장백%오강봉%장염경
gremlin1%诱变%真核表达
gremlin1%誘變%真覈錶達
gremlin1%유변%진핵표체
gremlin1%mutation%eukaryotic expression
目的:分别构建全长、无信号肽、无核定位系统和既无信号肽也无核定位系统的大鼠gremlin1基因的真核表达载体.方法:采用PCR技术获得全长大鼠gremlin1基因(gremlin1)和无信号肽的gremlin1基因(gremlin1-DS),以全长gremlin1为模板运用重叠延伸PCR获得无核定位系统的gremlin1基因(gremlin1-DN),继而在gremlin1-DN的基础上去掉信号肽获得既无信号肽也无核定位系统的gremlin1基因(gremlin1-DS-DN).分别将4组重组质粒转染到非洲绿猴肾细胞株cos7中,免疫荧光和蛋白免疫印迹检测gremlin1基因的表达.结果:构建的真核表达载体pEF1/Myc-HisC-gremlin1、pEF1/Myc-His C-gremlin1-DS、pEF1/Myc-His C-gremlin1-DN和pEF1/Myc-His C-gremlin1-DS-DN经PCR与酶切鉴定显示目的片段大小与预期结果一致；经DNA测序显示pEF1/Myc-His C-gremlin1中的gremlin1片段与Gene Bank中的gremlin1序列(NM-019282)完全吻合；pEF1/Myc-His C-gremlin1-DS中的gremlin1基因缺失信号肽序列；pEF1/Myc-His C-gremlin1-DN中的gremlin1片段实现了4个定点突变:433-435位的AAG(赖氨酸)、487-489位的CCA(脯氨酸)、490-492位的CCC(脯氨酸)、496-498位的AAG(赖氨酸)均突变为TTC(苯丙氨酸)；pEF1/Myc-His Cgremlin1-DS-DN中的gremlin1基因既缺失信号肽序列又实现了4个定点突变.将它们分别转染到cos7细胞后,免疫荧光和蛋白免疫印迹检测显示,4者均能在细胞内成功表达.结论:成功构建了pEF1/Myc-HisC-gremlin1、pEF1/Myc-HisC-gremlin1-DS、pEF1/Myc-His C-gremlin1-DN、pEF1/Myc-His C-gremlin1-DS-DN的真核表达载体.
目的:分彆構建全長、無信號肽、無覈定位繫統和既無信號肽也無覈定位繫統的大鼠gremlin1基因的真覈錶達載體.方法:採用PCR技術穫得全長大鼠gremlin1基因(gremlin1)和無信號肽的gremlin1基因(gremlin1-DS),以全長gremlin1為模闆運用重疊延伸PCR穫得無覈定位繫統的gremlin1基因(gremlin1-DN),繼而在gremlin1-DN的基礎上去掉信號肽穫得既無信號肽也無覈定位繫統的gremlin1基因(gremlin1-DS-DN).分彆將4組重組質粒轉染到非洲綠猴腎細胞株cos7中,免疫熒光和蛋白免疫印跡檢測gremlin1基因的錶達.結果:構建的真覈錶達載體pEF1/Myc-HisC-gremlin1、pEF1/Myc-His C-gremlin1-DS、pEF1/Myc-His C-gremlin1-DN和pEF1/Myc-His C-gremlin1-DS-DN經PCR與酶切鑒定顯示目的片段大小與預期結果一緻；經DNA測序顯示pEF1/Myc-His C-gremlin1中的gremlin1片段與Gene Bank中的gremlin1序列(NM-019282)完全吻閤；pEF1/Myc-His C-gremlin1-DS中的gremlin1基因缺失信號肽序列；pEF1/Myc-His C-gremlin1-DN中的gremlin1片段實現瞭4箇定點突變:433-435位的AAG(賴氨痠)、487-489位的CCA(脯氨痠)、490-492位的CCC(脯氨痠)、496-498位的AAG(賴氨痠)均突變為TTC(苯丙氨痠)；pEF1/Myc-His Cgremlin1-DS-DN中的gremlin1基因既缺失信號肽序列又實現瞭4箇定點突變.將它們分彆轉染到cos7細胞後,免疫熒光和蛋白免疫印跡檢測顯示,4者均能在細胞內成功錶達.結論:成功構建瞭pEF1/Myc-HisC-gremlin1、pEF1/Myc-HisC-gremlin1-DS、pEF1/Myc-His C-gremlin1-DN、pEF1/Myc-His C-gremlin1-DS-DN的真覈錶達載體.
목적:분별구건전장、무신호태、무핵정위계통화기무신호태야무핵정위계통적대서gremlin1기인적진핵표체재체.방법:채용PCR기술획득전장대서gremlin1기인(gremlin1)화무신호태적gremlin1기인(gremlin1-DS),이전장gremlin1위모판운용중첩연신PCR획득무핵정위계통적gremlin1기인(gremlin1-DN),계이재gremlin1-DN적기출상거도신호태획득기무신호태야무핵정위계통적gremlin1기인(gremlin1-DS-DN).분별장4조중조질립전염도비주록후신세포주cos7중,면역형광화단백면역인적검측gremlin1기인적표체.결과:구건적진핵표체재체pEF1/Myc-HisC-gremlin1、pEF1/Myc-His C-gremlin1-DS、pEF1/Myc-His C-gremlin1-DN화pEF1/Myc-His C-gremlin1-DS-DN경PCR여매절감정현시목적편단대소여예기결과일치；경DNA측서현시pEF1/Myc-His C-gremlin1중적gremlin1편단여Gene Bank중적gremlin1서렬(NM-019282)완전문합；pEF1/Myc-His C-gremlin1-DS중적gremlin1기인결실신호태서렬；pEF1/Myc-His C-gremlin1-DN중적gremlin1편단실현료4개정점돌변:433-435위적AAG(뢰안산)、487-489위적CCA(포안산)、490-492위적CCC(포안산)、496-498위적AAG(뢰안산)균돌변위TTC(분병안산)；pEF1/Myc-His Cgremlin1-DS-DN중적gremlin1기인기결실신호태서렬우실현료4개정점돌변.장타문분별전염도cos7세포후,면역형광화단백면역인적검측현시,4자균능재세포내성공표체.결론:성공구건료pEF1/Myc-HisC-gremlin1、pEF1/Myc-HisC-gremlin1-DS、pEF1/Myc-His C-gremlin1-DN、pEF1/Myc-His C-gremlin1-DS-DN적진핵표체재체.
