昆明医科大学学报
昆明醫科大學學報
곤명의과대학학보
Journal of Kunming Medical University
2013年
6期
26-29
,共4页
刘建军%胡月新%焦扬%赵瑜%杨静%何保丽
劉建軍%鬍月新%焦颺%趙瑜%楊靜%何保麗
류건군%호월신%초양%조유%양정%하보려
DLL4%原核表达%亲和层析%融合蛋白
DLL4%原覈錶達%親和層析%融閤蛋白
DLL4%원핵표체%친화층석%융합단백
目的 克隆肿瘤抗原人DLL4 基因,与原核表达载体可溶性融合表达、分离纯化及其鉴定,并计划将其应用于DLL4 特异性肺癌肿瘤疫苗研究过程中的抗血清滴度检测.方法 采用PCR 方法 扩增DLL4 多核苷酸序列,克隆入pMD-18T 载体.测序正确后,将其亚克隆入pGEX-KG 原核表达载体,获得pGEX-KG-hDLL4 载体.以该载体转化E.coli 菌株BL21(DE3),IPTG 诱导其表达,裂解大肠杆菌,以GSTrap 亲和层析柱纯化目的 蛋白,采用SDS-PAGE 电泳,Western Blot 方法 鉴定目的 蛋白的表达.结果PCR 扩增获得了hDLL4 基因片段,经测序证实与GenBank 公布的序列一致,重组的质粒经过PCR、酶切鉴定,证明重组质粒中已成功的插入了目的 基因hDLL4.成功构建了该蛋白的原核表达载体pGEX-KG-hDLL4.结论 融合蛋白GST-hDLL4 在25℃,IPTG终浓度0.5 mmol/L 条件下诱导表达,以GSTrap 亲和层析柱纯化,获得纯化融合蛋白.采用SDS-PAGE,WesternBlot 的方法 可检测到目的 可溶性融合蛋白GST-hDLL4 的表达.
目的 剋隆腫瘤抗原人DLL4 基因,與原覈錶達載體可溶性融閤錶達、分離純化及其鑒定,併計劃將其應用于DLL4 特異性肺癌腫瘤疫苗研究過程中的抗血清滴度檢測.方法 採用PCR 方法 擴增DLL4 多覈苷痠序列,剋隆入pMD-18T 載體.測序正確後,將其亞剋隆入pGEX-KG 原覈錶達載體,穫得pGEX-KG-hDLL4 載體.以該載體轉化E.coli 菌株BL21(DE3),IPTG 誘導其錶達,裂解大腸桿菌,以GSTrap 親和層析柱純化目的 蛋白,採用SDS-PAGE 電泳,Western Blot 方法 鑒定目的 蛋白的錶達.結果PCR 擴增穫得瞭hDLL4 基因片段,經測序證實與GenBank 公佈的序列一緻,重組的質粒經過PCR、酶切鑒定,證明重組質粒中已成功的插入瞭目的 基因hDLL4.成功構建瞭該蛋白的原覈錶達載體pGEX-KG-hDLL4.結論 融閤蛋白GST-hDLL4 在25℃,IPTG終濃度0.5 mmol/L 條件下誘導錶達,以GSTrap 親和層析柱純化,穫得純化融閤蛋白.採用SDS-PAGE,WesternBlot 的方法 可檢測到目的 可溶性融閤蛋白GST-hDLL4 的錶達.
목적 극륭종류항원인DLL4 기인,여원핵표체재체가용성융합표체、분리순화급기감정,병계화장기응용우DLL4 특이성폐암종류역묘연구과정중적항혈청적도검측.방법 채용PCR 방법 확증DLL4 다핵감산서렬,극륭입pMD-18T 재체.측서정학후,장기아극륭입pGEX-KG 원핵표체재체,획득pGEX-KG-hDLL4 재체.이해재체전화E.coli 균주BL21(DE3),IPTG 유도기표체,렬해대장간균,이GSTrap 친화층석주순화목적 단백,채용SDS-PAGE 전영,Western Blot 방법 감정목적 단백적표체.결과PCR 확증획득료hDLL4 기인편단,경측서증실여GenBank 공포적서렬일치,중조적질립경과PCR、매절감정,증명중조질립중이성공적삽입료목적 기인hDLL4.성공구건료해단백적원핵표체재체pGEX-KG-hDLL4.결론 융합단백GST-hDLL4 재25℃,IPTG종농도0.5 mmol/L 조건하유도표체,이GSTrap 친화층석주순화,획득순화융합단백.채용SDS-PAGE,WesternBlot 적방법 가검측도목적 가용성융합단백GST-hDLL4 적표체.
