东北农业大学学报
東北農業大學學報
동북농업대학학보
JOURNAL OF NORTHEAST AGRICULTURAL UNIVERSITY
2013年
5期
29-35
,共7页
李杰%李硕然%张谷楠%汪天虹%钟耀华%赵宁
李傑%李碩然%張穀楠%汪天虹%鐘耀華%趙寧
리걸%리석연%장곡남%왕천홍%종요화%조저
酸性蛋白酶%黑曲霉%重叠延伸PCR%ATMT
痠性蛋白酶%黑麯黴%重疊延伸PCR%ATMT
산성단백매%흑곡매%중첩연신PCR%ATMT
Acidic protease%Aspergillus niger,Overlap extension PCR%ATMT
通过重叠延伸PCR将宇佐米曲霉中1 347 bp的酸性蛋白酶基因pepA与黑曲霉耱化酶基因5′同源臂和3′同源臂进行拼接,构建pepA基因表达框.将此表达框插入载体pSZH中,构建黑曲霉同源重组表达载体pSZH-pepA.将裁体pSZH-pepA通过冻融法转化农杆菌AGL1,进而通过农杆菌介导法转化高产糖化酶的黑曲霉菌丝体.以PDA作为共培养培养基,乙酰丁香酮(简称AS)浓度200μmol·mL-1的条件下,28℃恒温静置培养48 h,经潮霉素筛选和PCR鉴定获得3株重组菌株.以出发菌株作为对照,对3株重组菌株静置培养7d后的发酵液上清进行酶活测定,结果发现酸性蛋白酶酶活最高达45.56 U· mL-1,而出发菌株的酸性蛋白酶酶活仅为3.72 U· mL-1,表明酸性蛋白酶基因pepA在高产糖化酶的黑曲霉中得到表达.研究建立了农杆菌介导的pepA基因导入黑曲霉菌丝体的转化体系,为实现酸性蛋白酶在黑由霉菌丝体中高效表达奠定基础.
通過重疊延伸PCR將宇佐米麯黴中1 347 bp的痠性蛋白酶基因pepA與黑麯黴耱化酶基因5′同源臂和3′同源臂進行拼接,構建pepA基因錶達框.將此錶達框插入載體pSZH中,構建黑麯黴同源重組錶達載體pSZH-pepA.將裁體pSZH-pepA通過凍融法轉化農桿菌AGL1,進而通過農桿菌介導法轉化高產糖化酶的黑麯黴菌絲體.以PDA作為共培養培養基,乙酰丁香酮(簡稱AS)濃度200μmol·mL-1的條件下,28℃恆溫靜置培養48 h,經潮黴素篩選和PCR鑒定穫得3株重組菌株.以齣髮菌株作為對照,對3株重組菌株靜置培養7d後的髮酵液上清進行酶活測定,結果髮現痠性蛋白酶酶活最高達45.56 U· mL-1,而齣髮菌株的痠性蛋白酶酶活僅為3.72 U· mL-1,錶明痠性蛋白酶基因pepA在高產糖化酶的黑麯黴中得到錶達.研究建立瞭農桿菌介導的pepA基因導入黑麯黴菌絲體的轉化體繫,為實現痠性蛋白酶在黑由黴菌絲體中高效錶達奠定基礎.
통과중첩연신PCR장우좌미곡매중1 347 bp적산성단백매기인pepA여흑곡매마화매기인5′동원비화3′동원비진행병접,구건pepA기인표체광.장차표체광삽입재체pSZH중,구건흑곡매동원중조표체재체pSZH-pepA.장재체pSZH-pepA통과동융법전화농간균AGL1,진이통과농간균개도법전화고산당화매적흑곡매균사체.이PDA작위공배양배양기,을선정향동(간칭AS)농도200μmol·mL-1적조건하,28℃항온정치배양48 h,경조매소사선화PCR감정획득3주중조균주.이출발균주작위대조,대3주중조균주정치배양7d후적발효액상청진행매활측정,결과발현산성단백매매활최고체45.56 U· mL-1,이출발균주적산성단백매매활부위3.72 U· mL-1,표명산성단백매기인pepA재고산당화매적흑곡매중득도표체.연구건립료농간균개도적pepA기인도입흑곡매균사체적전화체계,위실현산성단백매재흑유매균사체중고효표체전정기출.
