农业生物技术学报
農業生物技術學報
농업생물기술학보
JOURNAL OF AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY
2013年
8期
993-1001
,共9页
付常振%刘扬%昝林森%王虹%成功%王嘉力
付常振%劉颺%昝林森%王虹%成功%王嘉力
부상진%류양%잠림삼%왕홍%성공%왕가력
秦川牛%固醇调节元件结合蛋白2基因(SREBP2)%胆固醇%腺病毒
秦川牛%固醇調節元件結閤蛋白2基因(SREBP2)%膽固醇%腺病毒
진천우%고순조절원건결합단백2기인(SREBP2)%담고순%선병독
Qinchuan cattle%Sterol regulatory element binding protein 2 gene(SREBP2)%Cholesterol%Adenovirus
固醇调节元件结合蛋白2(sterol regulatory element binding protein 2,SREBP2)属于碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子家族,在胆固醇的代谢过程中具有重要的调控作用.克隆秦川牛(Bos taurus)的SREBP2基因并构建相应腺病毒过表达载体,包装扩繁获得高滴度腺病毒,对于在细胞水平上研究SREBP2基因的功能和作用机制具有重要作用.本研究以秦川牛脂肪组织为实验材料,提取总RNA并反转录为cDNA,依据GenBank收录的牛的SREBP2基因(Accession NO.NM_001205600)mRNA序列设计引物,克隆出SREBP2基因编码区(coding sequence,CDS)全长.将SREBP2基因与穿梭载体连接构建pAdTrack-CMV-SREBP2表达载体,用PmeⅠ分别酶切线性化pAdTrack-CMV-SREBP2和空白对照pAdTrack-CMV载体并转化含有骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌(Escherichia coli)BJ5183感受态进行同源重组,得到腺病毒重组载体pAd-SREBP2和pAd-CMV,分别用Pac Ⅰ酶切后胶回收DNA大片段,并将回收产物转染293A细胞包装得到腺病毒Ad-SREBP2和Ad-CMV,增殖并提高病毒滴度,得到高滴度病毒后,用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记法测定显示Ad-SREBP2和Ad-CMV的病毒滴度分别为7×108和1.3×109 GFU/mL.将Ad-SREBP2和Ad-CMV腺病毒侵染秦川牛前体脂肪细胞检测病毒的有效性,实时定量PCR检测结果显示,侵染48h时SREBP2基因的表达量提高了102.3倍.本研究成功克隆了秦川牛的SREBP2基因,构建了病毒重组体,包装增殖获得了高滴度病毒,为在细胞水平上基因功能的研究提供了基础资料.
固醇調節元件結閤蛋白2(sterol regulatory element binding protein 2,SREBP2)屬于堿性螺鏇-環-螺鏇亮氨痠拉鏈轉錄因子傢族,在膽固醇的代謝過程中具有重要的調控作用.剋隆秦川牛(Bos taurus)的SREBP2基因併構建相應腺病毒過錶達載體,包裝擴繁穫得高滴度腺病毒,對于在細胞水平上研究SREBP2基因的功能和作用機製具有重要作用.本研究以秦川牛脂肪組織為實驗材料,提取總RNA併反轉錄為cDNA,依據GenBank收錄的牛的SREBP2基因(Accession NO.NM_001205600)mRNA序列設計引物,剋隆齣SREBP2基因編碼區(coding sequence,CDS)全長.將SREBP2基因與穿梭載體連接構建pAdTrack-CMV-SREBP2錶達載體,用PmeⅠ分彆酶切線性化pAdTrack-CMV-SREBP2和空白對照pAdTrack-CMV載體併轉化含有骨架載體pAdEasy-1的大腸桿菌(Escherichia coli)BJ5183感受態進行同源重組,得到腺病毒重組載體pAd-SREBP2和pAd-CMV,分彆用Pac Ⅰ酶切後膠迴收DNA大片段,併將迴收產物轉染293A細胞包裝得到腺病毒Ad-SREBP2和Ad-CMV,增殖併提高病毒滴度,得到高滴度病毒後,用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)標記法測定顯示Ad-SREBP2和Ad-CMV的病毒滴度分彆為7×108和1.3×109 GFU/mL.將Ad-SREBP2和Ad-CMV腺病毒侵染秦川牛前體脂肪細胞檢測病毒的有效性,實時定量PCR檢測結果顯示,侵染48h時SREBP2基因的錶達量提高瞭102.3倍.本研究成功剋隆瞭秦川牛的SREBP2基因,構建瞭病毒重組體,包裝增殖穫得瞭高滴度病毒,為在細胞水平上基因功能的研究提供瞭基礎資料.
고순조절원건결합단백2(sterol regulatory element binding protein 2,SREBP2)속우감성라선-배-라선량안산랍련전록인자가족,재담고순적대사과정중구유중요적조공작용.극륭진천우(Bos taurus)적SREBP2기인병구건상응선병독과표체재체,포장확번획득고적도선병독,대우재세포수평상연구SREBP2기인적공능화작용궤제구유중요작용.본연구이진천우지방조직위실험재료,제취총RNA병반전록위cDNA,의거GenBank수록적우적SREBP2기인(Accession NO.NM_001205600)mRNA서렬설계인물,극륭출SREBP2기인편마구(coding sequence,CDS)전장.장SREBP2기인여천사재체련접구건pAdTrack-CMV-SREBP2표체재체,용PmeⅠ분별매절선성화pAdTrack-CMV-SREBP2화공백대조pAdTrack-CMV재체병전화함유골가재체pAdEasy-1적대장간균(Escherichia coli)BJ5183감수태진행동원중조,득도선병독중조재체pAd-SREBP2화pAd-CMV,분별용Pac Ⅰ매절후효회수DNA대편단,병장회수산물전염293A세포포장득도선병독Ad-SREBP2화Ad-CMV,증식병제고병독적도,득도고적도병독후,용록색형광단백(green fluorescent protein,GFP)표기법측정현시Ad-SREBP2화Ad-CMV적병독적도분별위7×108화1.3×109 GFU/mL.장Ad-SREBP2화Ad-CMV선병독침염진천우전체지방세포검측병독적유효성,실시정량PCR검측결과현시,침염48h시SREBP2기인적표체량제고료102.3배.본연구성공극륭료진천우적SREBP2기인,구건료병독중조체,포장증식획득료고적도병독,위재세포수평상기인공능적연구제공료기출자료.
