听力学及言语疾病杂志
聽力學及言語疾病雜誌
은역학급언어질병잡지
JOURNAL OF AUDIOLOGY AND SPEECH PATHOLOGY
2014年
4期
378-385
,共8页
张华%陈红胜%李家大%罗洪金%梅凌云%贺楚峰%冯永
張華%陳紅勝%李傢大%囉洪金%梅凌雲%賀楚峰%馮永
장화%진홍성%리가대%라홍금%매릉운%하초봉%풍영
Waardenburg综合征%小眼球畸形相关转录因子%基因突变%体外实验
Waardenburg綜閤徵%小眼毬畸形相關轉錄因子%基因突變%體外實驗
Waardenburg종합정%소안구기형상관전록인자%기인돌변%체외실험
Waardenburg%syndrome%(WS)%Microphthalmia-associated%transcription%factor%(MITF)%Gene%mutation%In%vitro
目的 通过体外实验研究小眼球畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)突变基因功能,初步探讨其致Ⅱ型Waardenburg综合征(Waardenburg syndrome,WS)发病的分子机制.方法 以野生型MITF基因真核细胞表达质粒pCMV-MITF-Flag为模板分别构建二个致Ⅱ型WS的MITF基因新发突变R217I和T192fsX18的真核细胞表达质粒.野生MITF和突变R217I和T192fsX18表达质粒瞬时转染黑色素瘤细胞或小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3细胞),应用Western blot和细胞免疫荧光分别检测其表达和亚细胞定位;应用荧光素酶活性检测系统通过对酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)报告基因活性检测观察野生/突变MITF蛋白对其靶基因TYR转录活性的调控作用,以及二个突变蛋白对野生MITF蛋白功能的影响;应用生物素标记的含E box基序(CATGTG)的DNA寡核苷酸链探针分别沉淀MITF、R217I及T192fsX18蛋白,检测野生/突变MITF蛋白与靶基因TYR启动子的结合力.结果 成功构建了突变型R217I、T192fsX18真核细胞重组表达质粒pCMV-R217I-Flag和pCMV-T192fsX18-Flag,MITF蛋白与R217I、T192fsX18突变蛋白在黑色素瘤细胞中正确表达,进一步验证了重组质粒构建的正确性.突变R217I蛋白与野生MITF蛋白一样仅在细胞核中分布,而T192fsX18蛋白则出现异常亚细胞定位,仅在细胞质中分布.尽管R217I蛋白仍残余部分功能可增加TYR启动子转录活性,但与野生MITF蛋白相比,二者差异有显著统计学意义(P＜0.01),而T192fsX18蛋白则完全失去调控TYR启动子转录活性作用(P＜0.01);二者均未对野生MITF蛋白功能产生显性负效应(P＞0.05).突变R217I蛋白与野生MITF蛋白均可与TYR启动子特异DNA序列E-box结合,而突变T192fs X18蛋白则不能与之结合.结论 R217I和T192fsX18突变蛋白通过影响靶基因TYR转录活性,使其表达下调、黑色素合成减少,以单倍体剂量不足效应致Ⅱ型WS.
目的 通過體外實驗研究小眼毬畸形相關轉錄因子(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)突變基因功能,初步探討其緻Ⅱ型Waardenburg綜閤徵(Waardenburg syndrome,WS)髮病的分子機製.方法 以野生型MITF基因真覈細胞錶達質粒pCMV-MITF-Flag為模闆分彆構建二箇緻Ⅱ型WS的MITF基因新髮突變R217I和T192fsX18的真覈細胞錶達質粒.野生MITF和突變R217I和T192fsX18錶達質粒瞬時轉染黑色素瘤細胞或小鼠胚胎成纖維細胞(NIH3T3細胞),應用Western blot和細胞免疫熒光分彆檢測其錶達和亞細胞定位;應用熒光素酶活性檢測繫統通過對酪氨痠酶(tyrosinase,TYR)報告基因活性檢測觀察野生/突變MITF蛋白對其靶基因TYR轉錄活性的調控作用,以及二箇突變蛋白對野生MITF蛋白功能的影響;應用生物素標記的含E box基序(CATGTG)的DNA寡覈苷痠鏈探針分彆沉澱MITF、R217I及T192fsX18蛋白,檢測野生/突變MITF蛋白與靶基因TYR啟動子的結閤力.結果 成功構建瞭突變型R217I、T192fsX18真覈細胞重組錶達質粒pCMV-R217I-Flag和pCMV-T192fsX18-Flag,MITF蛋白與R217I、T192fsX18突變蛋白在黑色素瘤細胞中正確錶達,進一步驗證瞭重組質粒構建的正確性.突變R217I蛋白與野生MITF蛋白一樣僅在細胞覈中分佈,而T192fsX18蛋白則齣現異常亞細胞定位,僅在細胞質中分佈.儘管R217I蛋白仍殘餘部分功能可增加TYR啟動子轉錄活性,但與野生MITF蛋白相比,二者差異有顯著統計學意義(P＜0.01),而T192fsX18蛋白則完全失去調控TYR啟動子轉錄活性作用(P＜0.01);二者均未對野生MITF蛋白功能產生顯性負效應(P＞0.05).突變R217I蛋白與野生MITF蛋白均可與TYR啟動子特異DNA序列E-box結閤,而突變T192fs X18蛋白則不能與之結閤.結論 R217I和T192fsX18突變蛋白通過影響靶基因TYR轉錄活性,使其錶達下調、黑色素閤成減少,以單倍體劑量不足效應緻Ⅱ型WS.
목적 통과체외실험연구소안구기형상관전록인자(microphthalmia-associated transcription factor,MITF)돌변기인공능,초보탐토기치Ⅱ형Waardenburg종합정(Waardenburg syndrome,WS)발병적분자궤제.방법 이야생형MITF기인진핵세포표체질립pCMV-MITF-Flag위모판분별구건이개치Ⅱ형WS적MITF기인신발돌변R217I화T192fsX18적진핵세포표체질립.야생MITF화돌변R217I화T192fsX18표체질립순시전염흑색소류세포혹소서배태성섬유세포(NIH3T3세포),응용Western blot화세포면역형광분별검측기표체화아세포정위;응용형광소매활성검측계통통과대락안산매(tyrosinase,TYR)보고기인활성검측관찰야생/돌변MITF단백대기파기인TYR전록활성적조공작용,이급이개돌변단백대야생MITF단백공능적영향;응용생물소표기적함E box기서(CATGTG)적DNA과핵감산련탐침분별침정MITF、R217I급T192fsX18단백,검측야생/돌변MITF단백여파기인TYR계동자적결합력.결과 성공구건료돌변형R217I、T192fsX18진핵세포중조표체질립pCMV-R217I-Flag화pCMV-T192fsX18-Flag,MITF단백여R217I、T192fsX18돌변단백재흑색소류세포중정학표체,진일보험증료중조질립구건적정학성.돌변R217I단백여야생MITF단백일양부재세포핵중분포,이T192fsX18단백칙출현이상아세포정위,부재세포질중분포.진관R217I단백잉잔여부분공능가증가TYR계동자전록활성,단여야생MITF단백상비,이자차이유현저통계학의의(P＜0.01),이T192fsX18단백칙완전실거조공TYR계동자전록활성작용(P＜0.01);이자균미대야생MITF단백공능산생현성부효응(P＞0.05).돌변R217I단백여야생MITF단백균가여TYR계동자특이DNA서렬E-box결합,이돌변T192fs X18단백칙불능여지결합.결론 R217I화T192fsX18돌변단백통과영향파기인TYR전록활성,사기표체하조、흑색소합성감소,이단배체제량불족효응치Ⅱ형WS.
