医学分子生物学杂志
醫學分子生物學雜誌
의학분자생물학잡지
FOREIGN MEDICAL SCIENCES
2013年
3期
154-157
,共4页
邱远欢%陆勤义%赵前峰%任翠平%沈际佳
邱遠歡%陸勤義%趙前峰%任翠平%瀋際佳
구원환%륙근의%조전봉%임취평%침제가
大肠癌%Sec61β蛋白%原核表达%多克隆抗体
大腸癌%Sec61β蛋白%原覈錶達%多剋隆抗體
대장암%Sec61β단백%원핵표체%다극륭항체
colorectal cancer%Sec61β protein%prokaryotic expression%polyclonal antibody
目的 构建人Sec61β基因的表达载体并在大肠埃希菌中表达Sec61β蛋白并制备多克隆抗体,为后续研究Sec61β蛋白及其自身抗体在人大肠癌诊断中的价值奠定基础.方法 用RT-PCR技术从人大肠癌组织中扩增出Sec61β基因,并与克隆载体pMD18-T连接转入XL1-BLUE克隆菌中,筛选出重组阳性菌落并提取质粒,用EcoR Ⅰ、Xhol Ⅰ将目的基因从重组克隆载体上切下并与同样双酶切后的表达载体pET-28a连接,转入表达菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达Sec61β重组蛋白,SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况.从SDS-PAGE凝胶上切取目的蛋白免疫家兔,获得抗血清.经镍柱纯化后复性获得基因重组蛋白,以该蛋白为抗原,间接ELISA法测定血清抗体效价.Western印迹法检测抗体特异性.结果 成功扩增出Sec61β基因(270 bp),并诱导表达出Sec61β基因工程蛋白,大小约为15 kD,以包涵体形式存在.制备的Sec61β多克隆抗体经Western印迹分析,可与人体组织中目的蛋白特异性结合.结论 成功构建了Sec61β的原核表达载体并在大肠埃希菌表达了人Sec61β蛋白,通过SDS-PAGE凝胶的方法切取重组蛋白免疫家兔获得了特异性多克隆抗体.
目的 構建人Sec61β基因的錶達載體併在大腸埃希菌中錶達Sec61β蛋白併製備多剋隆抗體,為後續研究Sec61β蛋白及其自身抗體在人大腸癌診斷中的價值奠定基礎.方法 用RT-PCR技術從人大腸癌組織中擴增齣Sec61β基因,併與剋隆載體pMD18-T連接轉入XL1-BLUE剋隆菌中,篩選齣重組暘性菌落併提取質粒,用EcoR Ⅰ、Xhol Ⅰ將目的基因從重組剋隆載體上切下併與同樣雙酶切後的錶達載體pET-28a連接,轉入錶達菌BL21(DE3)中,IPTG誘導錶達Sec61β重組蛋白,SDS-PAGE鑒定蛋白錶達情況.從SDS-PAGE凝膠上切取目的蛋白免疫傢兔,穫得抗血清.經鎳柱純化後複性穫得基因重組蛋白,以該蛋白為抗原,間接ELISA法測定血清抗體效價.Western印跡法檢測抗體特異性.結果 成功擴增齣Sec61β基因(270 bp),併誘導錶達齣Sec61β基因工程蛋白,大小約為15 kD,以包涵體形式存在.製備的Sec61β多剋隆抗體經Western印跡分析,可與人體組織中目的蛋白特異性結閤.結論 成功構建瞭Sec61β的原覈錶達載體併在大腸埃希菌錶達瞭人Sec61β蛋白,通過SDS-PAGE凝膠的方法切取重組蛋白免疫傢兔穫得瞭特異性多剋隆抗體.
목적 구건인Sec61β기인적표체재체병재대장애희균중표체Sec61β단백병제비다극륭항체,위후속연구Sec61β단백급기자신항체재인대장암진단중적개치전정기출.방법 용RT-PCR기술종인대장암조직중확증출Sec61β기인,병여극륭재체pMD18-T련접전입XL1-BLUE극륭균중,사선출중조양성균락병제취질립,용EcoR Ⅰ、Xhol Ⅰ장목적기인종중조극륭재체상절하병여동양쌍매절후적표체재체pET-28a련접,전입표체균BL21(DE3)중,IPTG유도표체Sec61β중조단백,SDS-PAGE감정단백표체정황.종SDS-PAGE응효상절취목적단백면역가토,획득항혈청.경얼주순화후복성획득기인중조단백,이해단백위항원,간접ELISA법측정혈청항체효개.Western인적법검측항체특이성.결과 성공확증출Sec61β기인(270 bp),병유도표체출Sec61β기인공정단백,대소약위15 kD,이포함체형식존재.제비적Sec61β다극륭항체경Western인적분석,가여인체조직중목적단백특이성결합.결론 성공구건료Sec61β적원핵표체재체병재대장애희균표체료인Sec61β단백,통과SDS-PAGE응효적방법절취중조단백면역가토획득료특이성다극륭항체.
