中华妇产科杂志
中華婦產科雜誌
중화부산과잡지
CHINESE JOUNAL OF OBSTETRICS AND GYNECOLOGY
2014年
7期
523-530
,共8页
石丽君%于红静%张玮%李力%王琪
石麗君%于紅靜%張瑋%李力%王琪
석려군%우홍정%장위%리력%왕기
卵巢肿瘤%顺铂%抗药性,肿瘤%细胞系,肿瘤%疾病模型,动物
卵巢腫瘤%順鉑%抗藥性,腫瘤%細胞繫,腫瘤%疾病模型,動物
란소종류%순박%항약성,종류%세포계,종류%질병모형,동물
Ovarian neoplasms%Cisplatin%Drug resistance,neoplasm%Cell line,tumor%Disease models,animal
目的：建立顺铂耐药性稳定的卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞株及其裸鼠移植瘤模型并探讨其耐药特性，为研究体内微环境耐药机制及逆转靶基因筛选奠定基础。方法采用体内外交叉诱导和连续体内诱导两种方法，以绿色荧光蛋白（GFP）标记的卵巢癌细胞株SKOV3/GFP分别建立两株顺铂耐药的卵巢癌细胞株SKOV3/DDPⅠ（为耐药细胞的对照）和SKOV3/DDPⅡ及其裸鼠移植瘤模型。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法和流式细胞仪检测细胞耐药指数，流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期比例，高效液相色谱仪检测细胞内顺铂积量；透射电镜观察移植瘤组织的超微结构，实时荧光定量PCR技术检测移植瘤组织中铂类耐药相关基因--PTEN、STAT5、XIAP、BRCA1和MDR1 mRNA的表达水平。结果成功构建顺铂耐药卵巢癌细胞株SKOV3/DDPⅠ和SKOV3/DDPⅡ及其裸鼠移植瘤模型。MTT比色法和流式细胞仪检测显示，SKOV3/DDPⅡ细胞的耐药指数分别为2.83±0.12和3.82±0.19，SKOV3/DDPⅠ细胞的耐药指数分别为2.20±0.16和3.40±0.20，两种检测方法分别比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。流式细胞仪检测显示，29.7和39.6μmol/L顺铂处理36 h后， SKOV3/DDPⅠ、SKOV3/DDPⅡ细胞的凋亡率[分别为（57.0±1.4）%、（74.4±2.3）%和（37.6±4.4）%、（50.5±3.4）%]均显著低于SKOV3/GFP细胞[（83.1±2.7）%和（87.4±4.0）%；P=0.024，P=0.001]，且SKOV3/DDPⅡ细胞的凋亡率明显低于SKOV3/DDPⅠ细胞（P=0.020）；SKOV3/DDPⅠ、SKOV3/DDPⅡ细胞G2/M期比例与顺铂处理时间（为0、12、24、36和48 h）呈正相关（R=0.800，P=0.104；R=0.915，P=0.029）。高效液相色谱仪检测显示，以9.9、19.8、29.7和39.6μmol/L的顺铂分别处理12、24、36和48 h后，SKOV3/DDPⅠ、SKOV3/DDPⅡ细胞内顺铂积量均显著低于SKOV3/GFP细胞（P<0.05）。透射电镜观察，接种SKOV3/GFP细胞的裸鼠移植瘤组织中，在腹腔内注射顺铂（为4 mg/kg）5次后，大部分细胞器降解，细胞核膜不完整；而接种SKOV3/DDPⅡ细胞的裸鼠移植瘤组织中，在腹腔内注射顺铂8次后才出现细胞器降解。实时荧光定量PCR技术检测显示，腹腔内注射顺铂8次后，接种SKOV3/DDPⅡ细胞的裸鼠移植瘤组织中PTEN mRNA的表达水平明显低于接种SKOV3/GFP细胞者（P=0.002）；STAT5、XIAP和BRCA1 mRNA的表达水平明显高于接种SKOV3/GFP细胞者（P<0.05）；而MDR1 mRNA几乎均无表达。结论本研究建立的顺铂耐药细胞株SKOV3/DDPⅡ具有稳定的耐药性。接种SKOV3/DDPⅡ细胞的裸鼠移植瘤组织过度表达BRCA1、XIAP、STAT5 mRNA，促进细胞DNA损伤修复、降低细胞凋亡、促进细胞增殖，而低表达PTEN mRNA则减弱了对细胞增殖的抑制作用，符合临床上铂类耐药细胞的耐药机制。
目的：建立順鉑耐藥性穩定的卵巢上皮性癌（卵巢癌）細胞株及其裸鼠移植瘤模型併探討其耐藥特性，為研究體內微環境耐藥機製及逆轉靶基因篩選奠定基礎。方法採用體內外交扠誘導和連續體內誘導兩種方法，以綠色熒光蛋白（GFP）標記的卵巢癌細胞株SKOV3/GFP分彆建立兩株順鉑耐藥的卵巢癌細胞株SKOV3/DDPⅠ（為耐藥細胞的對照）和SKOV3/DDPⅡ及其裸鼠移植瘤模型。採用四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法和流式細胞儀檢測細胞耐藥指數，流式細胞儀檢測細胞凋亡率和細胞週期比例，高效液相色譜儀檢測細胞內順鉑積量；透射電鏡觀察移植瘤組織的超微結構，實時熒光定量PCR技術檢測移植瘤組織中鉑類耐藥相關基因--PTEN、STAT5、XIAP、BRCA1和MDR1 mRNA的錶達水平。結果成功構建順鉑耐藥卵巢癌細胞株SKOV3/DDPⅠ和SKOV3/DDPⅡ及其裸鼠移植瘤模型。MTT比色法和流式細胞儀檢測顯示，SKOV3/DDPⅡ細胞的耐藥指數分彆為2.83±0.12和3.82±0.19，SKOV3/DDPⅠ細胞的耐藥指數分彆為2.20±0.16和3.40±0.20，兩種檢測方法分彆比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。流式細胞儀檢測顯示，29.7和39.6μmol/L順鉑處理36 h後， SKOV3/DDPⅠ、SKOV3/DDPⅡ細胞的凋亡率[分彆為（57.0±1.4）%、（74.4±2.3）%和（37.6±4.4）%、（50.5±3.4）%]均顯著低于SKOV3/GFP細胞[（83.1±2.7）%和（87.4±4.0）%；P=0.024，P=0.001]，且SKOV3/DDPⅡ細胞的凋亡率明顯低于SKOV3/DDPⅠ細胞（P=0.020）；SKOV3/DDPⅠ、SKOV3/DDPⅡ細胞G2/M期比例與順鉑處理時間（為0、12、24、36和48 h）呈正相關（R=0.800，P=0.104；R=0.915，P=0.029）。高效液相色譜儀檢測顯示，以9.9、19.8、29.7和39.6μmol/L的順鉑分彆處理12、24、36和48 h後，SKOV3/DDPⅠ、SKOV3/DDPⅡ細胞內順鉑積量均顯著低于SKOV3/GFP細胞（P<0.05）。透射電鏡觀察，接種SKOV3/GFP細胞的裸鼠移植瘤組織中，在腹腔內註射順鉑（為4 mg/kg）5次後，大部分細胞器降解，細胞覈膜不完整；而接種SKOV3/DDPⅡ細胞的裸鼠移植瘤組織中，在腹腔內註射順鉑8次後纔齣現細胞器降解。實時熒光定量PCR技術檢測顯示，腹腔內註射順鉑8次後，接種SKOV3/DDPⅡ細胞的裸鼠移植瘤組織中PTEN mRNA的錶達水平明顯低于接種SKOV3/GFP細胞者（P=0.002）；STAT5、XIAP和BRCA1 mRNA的錶達水平明顯高于接種SKOV3/GFP細胞者（P<0.05）；而MDR1 mRNA幾乎均無錶達。結論本研究建立的順鉑耐藥細胞株SKOV3/DDPⅡ具有穩定的耐藥性。接種SKOV3/DDPⅡ細胞的裸鼠移植瘤組織過度錶達BRCA1、XIAP、STAT5 mRNA，促進細胞DNA損傷脩複、降低細胞凋亡、促進細胞增殖，而低錶達PTEN mRNA則減弱瞭對細胞增殖的抑製作用，符閤臨床上鉑類耐藥細胞的耐藥機製。
목적：건립순박내약성은정적란소상피성암（란소암）세포주급기라서이식류모형병탐토기내약특성，위연구체내미배경내약궤제급역전파기인사선전정기출。방법채용체내외교차유도화련속체내유도량충방법，이록색형광단백（GFP）표기적란소암세포주SKOV3/GFP분별건립량주순박내약적란소암세포주SKOV3/DDPⅠ（위내약세포적대조）화SKOV3/DDPⅡ급기라서이식류모형。채용사갑기우담서람（MTT）비색법화류식세포의검측세포내약지수，류식세포의검측세포조망솔화세포주기비례，고효액상색보의검측세포내순박적량；투사전경관찰이식류조직적초미결구，실시형광정량PCR기술검측이식류조직중박류내약상관기인--PTEN、STAT5、XIAP、BRCA1화MDR1 mRNA적표체수평。결과성공구건순박내약란소암세포주SKOV3/DDPⅠ화SKOV3/DDPⅡ급기라서이식류모형。MTT비색법화류식세포의검측현시，SKOV3/DDPⅡ세포적내약지수분별위2.83±0.12화3.82±0.19，SKOV3/DDPⅠ세포적내약지수분별위2.20±0.16화3.40±0.20，량충검측방법분별비교，차이균유통계학의의（P<0.05）。류식세포의검측현시，29.7화39.6μmol/L순박처리36 h후， SKOV3/DDPⅠ、SKOV3/DDPⅡ세포적조망솔[분별위（57.0±1.4）%、（74.4±2.3）%화（37.6±4.4）%、（50.5±3.4）%]균현저저우SKOV3/GFP세포[（83.1±2.7）%화（87.4±4.0）%；P=0.024，P=0.001]，차SKOV3/DDPⅡ세포적조망솔명현저우SKOV3/DDPⅠ세포（P=0.020）；SKOV3/DDPⅠ、SKOV3/DDPⅡ세포G2/M기비례여순박처리시간（위0、12、24、36화48 h）정정상관（R=0.800，P=0.104；R=0.915，P=0.029）。고효액상색보의검측현시，이9.9、19.8、29.7화39.6μmol/L적순박분별처리12、24、36화48 h후，SKOV3/DDPⅠ、SKOV3/DDPⅡ세포내순박적량균현저저우SKOV3/GFP세포（P<0.05）。투사전경관찰，접충SKOV3/GFP세포적라서이식류조직중，재복강내주사순박（위4 mg/kg）5차후，대부분세포기강해，세포핵막불완정；이접충SKOV3/DDPⅡ세포적라서이식류조직중，재복강내주사순박8차후재출현세포기강해。실시형광정량PCR기술검측현시，복강내주사순박8차후，접충SKOV3/DDPⅡ세포적라서이식류조직중PTEN mRNA적표체수평명현저우접충SKOV3/GFP세포자（P=0.002）；STAT5、XIAP화BRCA1 mRNA적표체수평명현고우접충SKOV3/GFP세포자（P<0.05）；이MDR1 mRNA궤호균무표체。결론본연구건립적순박내약세포주SKOV3/DDPⅡ구유은정적내약성。접충SKOV3/DDPⅡ세포적라서이식류조직과도표체BRCA1、XIAP、STAT5 mRNA，촉진세포DNA손상수복、강저세포조망、촉진세포증식，이저표체PTEN mRNA칙감약료대세포증식적억제작용，부합림상상박류내약세포적내약궤제。
Objective To establish a platinum resistance nude mice model of epithelial ovarian cancer (EOC) and investigate its resistance to cisplatin (DDP) biological characteristics, so as to provide evidences for exploring chemoresistence mechanisms and screening for reversal targets in vivo micro-environment. Methods The resistance model was produced by repeating a crossover subcutaneous injection of human ovarian cancer SKOV3 cells labelled green fluorescent protein(GFP) and transplatation of tumor fragment into nude mice. Two kinds of cancer cell lines of SKOV3/DDPⅠand SKOV3/DDPⅡwere induced with acquired resistence to DDP. The chemosensitivities of EOC cells to DDP were tested and half maximal inhibitory concentration(IC50) was measured by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) and flow cytometry (FCS). Dynamic analysis among the concentration of DDP treatment and cell apoptosis, cell cycle phase distribution and intracellular DDP concentration. The expression of PTEN, STAT5, XIAP, BRCA1 and MDR1 were examined by real time quantitative reverser transcription PCR (qRT-PCR) in vivo. Results IC50 value of cisplatin for SKOV3/DDPⅡ were 2.83 ± 0.12 and 3.82 ± 0.19 folds than those for SKOV3/GFP by MTT and flow cytometry, separately. SKOV3/DDPⅠwere 2.20±0.16 and 3.40±0.20 folds. The apoptosis rate of SKOV3/DDPⅡ and SKOV3/DDPⅠ were decreased significantly at 29.7 and 39.6μmol/L DDP when treatment for 36 hours,which were lower than that of SKOV3/GFP cells [(57.0±1.4)%vs (37.6 ± 4.36)%vs (83.1 ± 2.71)%,P=0.024;(74.4 ± 2.3)%vs (50.5 ± 3.4)%vs (87.4 ± 4.0)%,P=0.001]. SKOV3/DDPⅠ and SKOV3/DDPⅡ was positively related with cisplatin processing time. Intracellular DDP accumulation of SKOV3/DDPⅡand SKOV3/DDPⅠwere lower than SKOV3-GFP in dynamic processes(P<0.05). Besides intracellular DDP accumulation of SKOV3/DDPⅡ also lower than SKOV3/DDPⅠin dynamic processes (P<0.05). Transplanted tumor of SKOV3/GFP appeared organelle degradation and nuclear membrane imcompleted after five times DDP injection with concentration of 4 mg/kg. SKOV3/DDPⅡand SKOV3/DDPⅠdid not generate these phenomenon untill eighth DDP injections with concentration of 4 mg/kg. STAT5 and BRCA1 of SKOV3/DDPⅡwere increased with DDP treatment at concentration of 4 mg/kg. Expression of XIAP from SKOV3/DDPⅡwas positive correlated with injection times. STAT5,XIAP and BRCA1 of SKOV3/DDPⅡwere up-regulated 3.86,28.1 and 14.6 folds than those in SKOV3/GFP cells after eighth DDP treatment, separately. While PTEN of SKOV3/DDP Ⅱ was decreased 3.77 folds. Conclusions We have successfully established platinum-resistent EOC mice model,which provides a new platform for further study on chemoresistant reversal and individualized clinical treatment. The results shown that potential mechanisms of SKOV3/DDPⅡDDP-resistance included over-expressed BRCA1 gene may be promote DNA damage repair, elevate XIAP gene to decrease cell apoptosis,up-regulated STAT5 gene and decrease PTEN gene to stimulate proliferation.
